甘蓝型油菜乙醇酸氧化酶(GO)基因片段的克隆及hpRNA表达载体构建

通过PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus)华双4号基因组DNA中扩增出乙醇酸氧化酶(GO)基因片段,DNA序列分析表明扩增GO基因片段的外显子部分与报道序列相同.以扩增出的GO基因片段作模板从一端设计引物扩增出一个相应的小片段.将GO基因大小两个片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜hpRNA干扰载体.     

一种简单有效的T7RNA聚合酶调控的植物基因表达系统

T7RNA聚合酶在原核系统的基因表达与调控中起重要作用.将T7RNA聚合酶基因的5'端与来自SV40大T抗原基因的核定位信号编码序列融合在一起,利用rolC启动子控制修饰的T7RNA聚合酶基因,与10启动子控制的β-葡萄糖醛酸酶基因串联在一起,构建了植物表达载体,通过基因枪介导法转化了烟草叶片.结果表明,这一表达系统能够增加β-葡萄糖醛酸酶基因的瞬时表达.这为提高外源基因在转基因植物中的高效表达提供了新的工具.     

新型DNA聚合酶Tgo的扩增忠实性测定

用分子克隆技术从Thermococcus gorgonarius克隆并表达重组Tgo DNA聚合酶， 得到纯化的热稳定Tgo DNA聚合酶. 利用重组酶成功扩增了质粒pUC19、 野大麦Na⁺/H⁺逆向运转蛋白基因、 小鼠Cx37基因和人CYT2C9基因. 该酶的扩增性能与Taq酶相当， 而扩增忠实性分别比Taq酶、 Pfu酶高30倍和1.6倍.     

重组Pol D DNA聚合酶的纯化及其功能初步研究

为研究古菌Pol D DNA聚合酶两个亚基的功能及其相互作用,对重组超嗜热硫还原古菌Thermococcus sp.4557 Pol D DNA聚合酶小亚基DP1和大亚基DP2进行柱层析纯化,采用荧光标记核酸结合聚丙烯酰胺凝胶电泳实验对两个亚基体外功能进行研究。结果表明,DP2具有DNA复制延伸活性,DP1具有3''→5''外切核酸酶活性;DP1在与DP2的浓度比高于0.3∶1时可降解DP2的延伸产物;DP2对DP1的外切核酸酶活性有促进作用,Sld5和Psf1蛋白复合体(Sld5 and Psf1 Complex,GINS 51)对DP1的外切核酸酶活性有抑制作用。古菌Pol D DNA聚合酶大小亚基的功能及其相互作用对DNA复制机制的进一步认识有借鉴意义。     

苦瓜(Momordica Charantia L.) MADS-box基因BAG启动子的克隆分析及表达载体的构建

作者提取苦瓜基因组总DNA，构建了DNA步移文库，并根据已克隆并公布的苦瓜MADS-box基因BAG的基因序列设计引物，通过染色体步移技术克隆出BAG基因起始密码子上游调控序列BAGP．对BAGP的鉴定和分析表明其具备大多数高等植物启动子的保守元件，预测它对BAG基因的表达具有一定的作用．为鉴定BAG基因的基本启动子元件。将基因5′侧翼序列做缺失片段分析，利用PCR方法从BAGP中得到3个大小不等两端带有HindⅢ,BamHⅠ酶切位点的片段BAGPl，BAGP2和BAGP3，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP)中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报告基因GFP的植物表达裁体BAGPVl，BAGPV2和BAGPV3．     

sⅡ系列缺失启动子载体的构建

为检测新型sII根部特异启动子的功能,采用PCR的方法,扩增胡萝卜根部特异启动子sII基因的启动子序列,得到该启动子-650bp和-1000bp区域片段.在启动子片段的5'和3'端分别引入了克隆所需的限制性酶切位点,分别定向克隆到经改造的质粒载体pBI121和pBITM2MARⅡ中,取代原有的组成型启动子CaMV35S,获得了四个含有胡萝卜根部特异启动子sII基因不同缺失片段区域与GUS报告基因的融合检测载体.该系列载体通过农杆菌介导转入胡萝卜,检测sII不同长度片段启动子在胡萝卜根部驱动报告基因的表达情况,分析该启动子的功能.     

ChsA启动子驱动的IPT基因植物表达载体的构建

为研究异戊烯腺苷类细胞分裂素与花衰老进程的相关性,本研究通过PCR方法从矮牵牛中克隆到花瓣特异性表达的矮牵牛查尔酮合成酶基因A(ChsA)的启动子PchsA,并以其取代植物表达载体pBI121中的组成型启动子CaMV35S,然后将IPT基因插入到PchsA启动子下游,测序结果显示花瓣特异性启动子驱动的IPT植物表达载体构建成功.     

水稻精细胞基因RSSG58启动子的克隆分析及表达载体构建

根据分布的水稻基因组测序的比较和水稻精细胞优势表达的RSSG58基因cDNA序列，以水稻品种“桂朝2号”黄化苗组DNA为模板，用PCR方法克隆出RSSG58在起始密码子以前的上游调控序列Pr58，经过Pr58启动子进行的鉴定和分析表明，具备大多数高等植物启动子的保守元件，预计它的RSSG58基因在特异表达方面具有一定的作用。为了鉴定RSSG58基因的基本启动子元件，将RSSG58基因5′侧翼序列做缺失片段分析，由PCR从Pr58中得以3个不同大小两端带有HindⅢ，BamHⅠ酶切位点的片段Pr58Ⅰ，Pr58Ⅱ和Pr58Ⅲ，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP）中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报造基因GFP的植物表达载体pRGFPⅠ，pRGFPⅡ和pRGFPⅢ，用于农杆菌介导法水稻遗传转化。其目的是为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定基础。     

甘草水通道蛋白PIP1基因正义和反义表达载体的构建

根据已报道的GuPIP1基因序列设计特异引物,克隆甘草水通道蛋白GuPIP1基因cDNA序列,将该片段正向、反向分别插入植物表达载体pMBW330的CaMV35S启动子和OCS终止子之间,构建了正义、反义表达载体．通过双酶切、PER和DNA测序鉴定后,分别导入农杆菌EHA105中．     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法，从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN，并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box，6个Gobox和多种植物顺式作用元件，但没有发现典型的TATA-box，推测为一种特殊的启动子结构，为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件，将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp，260bp)定向插入载体pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子，构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1，pRGUS2，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉，快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域，结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达，可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

应用于PCR技术的DNA聚合酶

DNA聚合酶作为聚合酶链式反应（PCR）的重要因素之一,在PCR过程中起着至关重要的作用,在某种意义上甚至可以说,PCR技术就是耐热DNA聚合酶的技术。故综合研究聚合酶并改善其酶学性能,已成为分子生物学工作者关注的热点之一。本文就PCR技术产生至今DNA聚合酶的研究历史及现状进行简要综述。     

重组TgoDNA聚合酶的特性

检测了重组Tgo酶的扩增性能、 耐热性以及长距离PCR能力， 结果表明, 该重组酶扩增性能与Taq酶相当； 其耐热性极强， 在 95 ℃ 40 min， 仍具有很强的聚合活性； 利用重组酶在常规PCR条件下， 成功扩增了5.3　kb的拟南芥Timeless基因片段.     

PCR技术详解及分析

介绍了PCR技术的发展过程、工作原理、反应要素、应用及质控条件,并对常见PCR技术问题进行了深入分析,同时也对新发展起来的PCR技术(荧光PCR、交转录PCR、原位PCR、单细胞PCR等)做了介绍,并提出了关健性的解决方法。     

PCR技术检测致病真菌感染的研究

目的建立适合临床实践的常见致病真菌的PCR检测方法。方法根据真菌的保守基因设计不同的特异性引物,对152例临床标本进行PCR检测,与传统检验方法的结果进行比较。结果真菌培养阳性46例;真菌PCR检测阳性57例,分别为白色念珠菌感染30份、烟曲霉感染9份、黄曲菌感染8份,其他真菌感染10份。两种方法比较,检出率差异无统计学意义。结论 PCR法可快速、特异、灵敏地检测致病真菌,适合临床实验室的快速诊断。     

应用聚合酶链式反应检测犬细小病毒

将具有犬细小病毒病典型症状的病犬肠溶物经ＳＤＳ－酚裂解法提取总ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,通过人工合成的两条２０ｍｅｒ引物进行ＰＣＲ扩增,该对引物扩增的片段为犬细小病毒结构蛋白ＶＰ２基因中间１／３区段,ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳,试验结果表明：用ＰＣＲ扩增检测犬细小病毒具有良好的特异性,应用该方法检测的２７份病犬肠溶物样品块获得了预计长度的ＤＮＡ片段（５３１ｂｐ）,而健康犬的肠溶物样品ＰＣＲ结果为     

多聚酶链反应技术在淋病检测上的应用

本文应用多聚酶链反应（ＰｏｌｇｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术对直接涂片镜检淋球菌阴性患者１００例进行淋球菌ｃｐｐＢ基因片段测定。其中ＰＣＲ阳性者高达５４例，占５４％，该组病人中有２０例尖锐湿疣患者，其中ＰＣＲ阳性者１３例，占６５％。以上结果提示：ＰＣＲ技术可明显提高淋病患者的检出率。     

在食品检验中应用聚合酶链反应技术(PCR)

聚合酶链反应(PCR)技术,现已在医学工程、疾病诊断、遗传工程、考古学及法医学等领域得到广泛应用,由于该技术具有灵敏、特异、产量高、速操作简便和容易自动化等突出优点,因此,也被应用于食品检验.本文就PCR技术的原理及在食品卫生检验中的应用作一综述.