抗CPAα毒素单链抗体基因的克隆和表达及其生物学特性研究

应用RT—PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌 (CPA)α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其定向克隆于表达载体 pHOG2 1中 ,构建重组表达载体 pHOG 2E3,转化至大肠杆菌XL1 Blue中 ,筛选出表达菌株XL1 Blue(pHOG 2E3)。SDS PAGE分析结果表明 ,在 2 0℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %,ScFv蛋白主要以包涵体的形式存在 ,但在胞周质和培养上清中也能检测到ScFv蛋白 ,其中在胞周质中表达的ScFv蛋白占菌体可溶性蛋白的 4 %。生物学试验结果表明 ,ScFv基因表达产物不仅能够中和α毒素的磷酯酶C活性 ,而且对攻击致死剂量α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用     

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将2种抗A型产气英膜梭菌α毒素单链抗体（ScFv）基因ScFv－2E3和ScFV-1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET-20b,pET-28a和pHOG21中,构建了重组质粒PUC2E3和pUC-1A8,pET20b-2E3和pET20b-1A9,pET28a-2E3和pET28a-1A8以及pHOG-2E3和pHOG-1A8,然后分别转化至大肠杆菌中,提取质粒,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段,说明已成功构建了8个含ScFv基因的表达质粒。     

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv - 2E3和ScFV - 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET - 2 0b ,pET - 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒PUC -2E3和pUC - 1A8,pET2 0b - 2E3和pET2 0b - 1A8,pET2 8a - 2E3和pET2 8a - 1A8以及pHOG - 2E3和pHOG - 1A8,然后分别转化至大肠杆菌中 ,提取质粒 ,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析 ,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段 ,说明已成功构建了 8个含ScFv基因的表达质粒     

抗肺癌单链抗体融合胸腺素α1重组体的构建

以重组质粒pET39-Tα1为模板,PCR获得Tα1基因,连接到pUCm—T载体上。对质粒pET22-SeFv、pUCm—T—Tα1双酶切,回收相应片段,将Tα1连接到SeFv的C端,成功构建pET22-SeFv—Tα1重组体。     

鼠源单抗3G1单链抗体基因的构建及序列分析

利用Rr—PCR方法，从分泌抗汉滩病毒mAb的杂交瘤细胞系3Gl中扩增出抗体VH和VL基因，通过PCR方法获得1inker—VL基因，进而利用加端PCR技术，在扩增出的单抗体VH和1inker—VL基因两端加上限制性酶切位点，分别克隆入pUCl8中并测序．3Gl VH基因长360bp，编码120个氨基酸；VL基因长324bp，编码108个氨基酸．在pUCl8载体中将VH和1inker—VL基因连接成ScFv基因．     

鼠源抗AFB1噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

研究以AFB1-BSA免疫的小鼠脾脏细胞为试验材料,利用RT-PCR技术,克隆了抗AFB1抗体重链和轻链可变区基因VH和VL,利用连接肽(Gly4Ser)3将VH和VL链接成单链抗体基因scFv,通过噬菌体展示载体pCANTAB-5E携带将其电转化E.coli TG1,经氨苄青霉素平板筛选,构建了库容为2.13×109 cfu/μg DNA的噬菌体单链抗体库,抗体库的克隆阳性率达到100%,且多样性良好,为高活性抗AFB1单链抗体的筛选提供了材料基础。     

抗膀胱癌单链抗体基因在烟草中的表达

以抗膀胱癌单链抗体（ｓｃＦＶ）基因为目的基因,构建植物表达载体,转化烟草,研究医用治疗性工程抗体基因在植物中的表达,结果表明,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定出的转基因植株,叶片提取物的蛋白电泳有特异带出现,其分子量约为２７ｋｕ,同预期的单链抗体分子量一致,表达量最一株,抗体含量占可溶性蛋白的１．４％,竞争性抑制ＥＬＩＳＡ测定结果显示,该抗体有抗原结合活性。     

抗牙周病厌氧菌单链抗体基因的构建与表达

从牙周病厌氧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株出发，通过基因工程方法－ＰＣＲ技术，调出其抗体的重链和轻链基因可变区序列，体外重组后得到单链抗体片段，克隆到了ｐＣＡＮＴＡＢ５载体上，在ＴＧ１中得到了成功表达。     

抗人红细胞单链抗体基因的构建及表达

从分泌抗人红细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞３Ｆ５中提取总ＲＮＡ,逆转录成ｃＤＮＡ,用合成的寡核苷酸引物通过ＰＣＲ扩增和克隆单抗的轻、重链可变区基因,用双脱氧核苷酸链终止法分析核苷酸序列,采用ＰＣＲ拼接法构建单链抗体基因,并插入原核表达载体ＰＥｔ－２８ａ,转化大砀杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,经ＩＰＴＧ诱导后表达,序 分析表明所克隆的ＶＬ、ＶＨ分别属于鼠ＩｇＫａｐｐａ轻链ＩＶ亚组和Ｉｇ重链Ⅱ亚组,ＶＨ、ＶＬ基     

噬菌体显示抗乳腺癌单链抗体的基因克隆和筛选

克隆和连接乳腺癌杂交瘤单克隆抗体的轻、重链可变区基因,构建该单链抗体的噬菌体显示系统,经严格的相关肿瘤细胞株的固相细胞正负筛选和多步液相结合-洗脱细胞筛选,得到特异性高、亲和力强的单链抗体基因,用于进一步构建重组免疫毒素,为临床乳腺癌和生物靶向治疗奠定基础.     

半夏属植物凝集素基因片段克隆与序列分析

半夏属植物凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,有3个甘露糖专一结合位点,且具显著的抗虫性.本研究根据已知掌叶半夏凝集素基因表达序列的相关信息设计引物,采用RT-PCR方法,分别从滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏中克隆出长约530bp的凝集素基因片段.使用Genescan软件、ORF finder软件、Ex2PASy Proteomics Server软件对5个凝集素基因片段进行分析,结果表明:克隆出的滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏凝集素基因片段分别编码107、171、170、170、170个氨基酸,在它们所编码的肽链中,都具有酪蛋白激酶II磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和N-糖基化位点三类不同的功能位点.但由于编码序列碱基的突变,引起肽链中的氨基酸发生变化,从而导致这五种植株的凝集素基因存在较高的多态性以及存在功能位点的差异.其凝集素基因多态性及功能位点的差异对凝集素功能的影响需进一步分析.本实验为克隆五种植物凝集素基因的表达序列与结构基因以及深入研究半夏属凝集素的功能提供了有意义的参考资料.     

茂原链霉菌谷氨酰胺转胺酶基因克隆、序列分析及原核表达

以茂原链霉菌(Streptomyces m obaraensis)的基因组DNA为模板,利用PCR的方法扩增出谷氨酰胺转胺酶(Transglutam inase,TGase)的完整基因片段.序列分析结果表明,该片段全长1 246 bp,包含一个完整的ORF,长度1 146 bp,编码395 aa,分子量为44 kD左右.该基因的核酸序列及推导的氨基酸序列同已知微生物来源的若干TGase相比,序列相似性均很高,并且发现与酶催化活性有关的一些motif,如酰胺化位点等;在此基础上,又进一步对其二级结构进行分析并完成了TGase三维结构的建模.将编码TGase酶的基因片段插入到原核表达载体pQE30Xa中,并转化大肠杆菌(E.coliJM109).SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导后该基因得到表达,表达产物的酶活为2.2 U/mL.     

小菜蛾泛素基因的克隆及序列分析

设计了一对简并引物,从小菜蛾Plutella Xylostella(L.)抗溴氰菊酯品系和敏感品系的雌雄成虫基因组中分别克隆了泛素基因的编码区,GenBank登录号分别为EU28778,EU28779,EU28780,EU28781.序列分析表明,该基因的长度为228bp,编码的多肽由76个氨基酸组成.不同品系和不同性别的小菜蛾泛素基因的核苷酸序列、氨基酸序列等均存在差异,其中敏感品系雌雄成虫间差异较大,序列相似性为81.1%;抗性品系雌雄成虫间差异较小,序列相似性为97.8%.推测这些差异可能与小菜蛾抗药性的形成有关.因而为进一步研究小菜蛾抗药性形成机制和遗传机理奠定了基础.     

斜纹夜蛾NPV多角体基因的克隆和部分测序

本文对ＳＩＮＰＶ基因组作了酶解分析，测得其基因组大小为１４５ｋｂ，并用双酶法确定了ＳＩＮＰＶ基因组的ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ物理图谱。以含ＡｃＮＰＶ多角体基因的质粒ｐＡＣ－Ⅰ的ＳａｌＩ－Ｃ片段为探针，对ＳＩＮＰＶＤＮＡ酶切片段ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印杂交结果，初步判断多角体基因定位于ＰｓｔＩ－Ｂ／Ｃ／Ｄ片段、ＢｇｌⅡ－Ｃ／Ｄ片段、ＢａｍＨＩ－Ｂ／Ｃ片段和ＥｃｏＲＩ－Ａ／Ｂ片段上，且ＳＩＮＰＶ与ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因有６４％的同源性，而以大肠仟菌质粒ｐＵＣ１９为载体对ＳＩＮＰＶ的多角体基因试克隆，得到带有ＢｇｌⅡ－ＰｓｔⅠ双酶切片段的２个克隆子。对这两个杂交阳性克隆子之一的核苷酸序列测定，表明插入片段与ＢｍＮＰＶ多角体基因上游序列亦有一定同源性。     

大熊猫IL-2基因的克隆与序列分析

本实验应用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术，从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫IL-2基因，并将其克隆到PGEM-T载体中．经菌落PER鉴定、序列测定及序列分析，结果表明，经克隆得到的IL-2基因开放阅读框由465个核苷酸组成，编码一个由155个氮基酸组成的多肽，包括编码20个氨基酸的信号肽和135个氨基酸的成熟肽，该基因（已在Genbank中登录，序列号为：DQ852339）与已知的其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的IL-2核苷酸同源性在66.5％（鼠）～91．5％（犬）之间；IL-2编码氨基酸同源性在54．8％（鼠）-85．2％（犬）之间；进化树构建结果表明大熊猫与犬亲缘关系最近．     

对硝基酚磷酸酶pNPPase的基因克隆和序列分析

对硝基酚磷酸酶（p-nitrophenylphosphatase pNPPase)是一种对硝基酚磷酸盐（p-intophenylphosphate)为底物的酶,被广泛地应用于核酸标记,通过菌落原位显色法成功地从脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus)中克隆到了编码耐热pNPPase的基因,序列分析表明它是一个编码255个氨基酸的酶。     

马铃薯卷叶病毒中国分离株外壳蛋白基因及其上游先导序列的cDNA克隆和序列分析

按照马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）核苷酸序列，针对ＣＰ基因及其上游基因间隔区全长约０．８ｋｂ的区段设计合成两个特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）的ＲＮＡ为模板，反转录合成ＣＤＮＡ第一条链，再经ＰＣＲ扩增合成ｃＤＮＡ，将ＣＤＮＡ克隆于ｐＵＣ１９质粒．限制性酶切分析和核苷酸序列测定表明克隆的ＰＬＲＶ－Ｃｈ外壳蛋白（ＣＰ）基因及其上游基因间隔区的全长ＣＤＮＡ共８２４个核苷酸，与国外报道的４个ＰＬＲＶ分离株的核苷梳序列相比具有高度同源性．ＰＬＲＶ的外壳蛋白基因序列与其上游基因间隔区相比保守性更强．     

拟南芥耐干旱相关转录因子DREB1A基因的克隆及序列分析

设计引物利用PCR技术从拟南芥中克隆与植物耐旱相关序列DRE相结合的转录因子DREB1A的基因,得到扩增谱带后,进行TA克隆,经蓝白斑筛选获得pDREB重组质粒,经PCR验证和序列测定确认扩增所得片段为DREB1A基因,并对该基因序列进行了分析.