中药大青叶有效单体抗流感病毒作用

采用中药大青叶有效单体进行体外抗流感病毒(H1N1)的研究,通过观察病毒引起的细胞病变效应(CPE)、 MTT法检测细胞活性,红细胞凝集实验检测病毒血凝滴度,考核药物的抗病毒作用.结果表明:大青叶有效单体1#, 2#, 3#, 4#对流感病毒无直接灭活作用,也不能阻止流感病毒的吸附,而能抑制流感病毒在MDCK细胞内的的生物合成.其半数抑制浓度(IC50)分别为30.80, 29.74, 27.56, 25.85 mg/L,治疗指数(TI) 分别为6.33, 9.30, 10.77, 15.05. 其抗流感病毒效果优于病毒唑(IC50=101.05 mg/L, TI =5.25),和抗病毒口服液(IC50=104.41 mg/L, TI=5.03), P<0.01.在160 mg/L时能抑制流感病毒在MDCK细胞内的增殖达90 %左右.在40～160 mg/L内大青叶1#, 2#, 3#, 4#单体能明显降低流感病毒血凝滴度(P<0.05).大青叶有效单体1#, 2#, 3#, 4#能安全高效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.     

昆虫病毒对人类体细胞的致突变性研究

用姐妹染色单体互换(SCE)和染色体畸变分析的方法,检测不同浓度的3种昆虫病毒(BpNPV、DtGV、DpCPV)对人类体细胞的致突变作用,以细胞遗传学方法来评价3种昆虫病毒的“潜在性危害”。结果表明,3种昆虫病毒对人类体细胞不具有致突变作用.     

小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。     

复方中药的体外抗病毒效果评价

根据中兽医理论选择具有清热解毒作用的黄芩、黄柏等十四味中药组方, 经水提(1#、2#)和醇提(3#、4#)制备了4种提取物, 以致病变型牛腹泻粘膜病病毒(BVDV)为模式病毒, 在犊牛睾丸细胞上评价其体外抗病毒活性. 首先在犊牛睾丸细胞上测定4种提取物的最大无毒浓度, 再按此无毒浓度和BVDV(200 TCID50)共同感染犊牛睾丸细胞, 设立BVDV病毒对照和空白对照组. 通过观察细胞形态的变化来判断结果. 结果显示4种提取物的最大无毒浓度均为1:64, 与病毒对照组相比1#提取物能使犊牛睾丸细胞出现细胞病变(CPE)的时间推迟48h, 2#、3#提取物推迟72h, 4#提取物推迟120h. 本试验证实这4种复方中药提取物在犊牛睾丸细胞上均有抑杀BVDV的效果, 为今后筛选有效的抗病毒中药复方奠定了基础.     

中药大黄抗柯萨奇病毒作用的实验研究

采用大黄1～4#有效提取部位进行了体外抗柯萨奇病毒B3(CVB3)的研究.通过观察病毒引起的细胞病变效应(CPE)、MTT法检测细胞活性,作为考核药物抗病毒作用.结果表明:大黄1～4#有效提取部位对CVB3无直接灭活作用,也不能阻止CVB3的吸附,而能抑制CVB3在Hep-2细胞内的的生物合成,其半数抑制浓度(IC50)分别为34.7、33.0、33.9、34.3 mg/L,治疗指数(TI)分别为7.2、7.6、7.6、7.2.与病毒唑(IC50=30.6 mg/L,TI=6.6,P＞0.01)相当,优于大黄提取液(IC50=48.5 mg/L,TI=4.7,P＜0.01).在2.5～120 mg/L范围内1～4#部位与CVB3抑制率呈明显的量效关系(P＜0.01),120 mg/L时能完全抑制CVB3在Hep-2细胞内的增殖.所以大黄1～4#有效提取部位安全高效地抑制CVB3在Hep-2细胞中的增殖.     

培养细胞体系中槐定碱抗EV71病毒的作用

探究槐定碱抗EV71病毒的作用,为防治手足口病提供线索。在体外培养的Vero细胞体系中加入槐定碱,用MTT法检测其细胞毒性;在病毒感染的不同时期用槐定碱处理,用MTT法检测细胞存活率、细胞病变等指标,表征其对EV71病毒吸附、穿入的抑制作用及直接杀灭作用;用RT-PCR法检测其对于病毒RNA复制的抑制作用。(1)槐定碱具有一定细胞毒性,其CC50为1.414mg/m L;(2)能够抑制病毒对Vero细胞的感染,其IC50=0.354mg/m L;(3)其机制可能是抑制病毒的吸附和RNA复制,但对病毒穿入的抑制作用较弱。槐定碱可抑制病毒吸附和病毒增殖,在病毒感染前后用药效果都较好,且有效浓度远小于其CC50值,作为防治手足口病药物的开发潜力较大。     

HCV RNA复制过程中5''UTR与3''UTR 作用的初步探讨

构建具有不同类型和长度的5'非编码区(UTR)及3'UTR的丙型肝炎病毒(HCV)全长cDNA克隆,体外转录制备RNA,转染肝癌细胞HepG2,研究不同RNA转录体在细胞内的复制情况。通过RT-PCR与Westernblot等方法证明:蛋白编码区来源于1a基因型并具有1b型5'UTR及3'UTR(全长或缺失98nt保守区)的2种嵌合型HCVRNA,都可以在病毒易感细胞中复制和表达;而以脑心肌炎病毒(EMCV)内核糖体进入位点(IRES)替代HCV5'UTR的嵌合型RNA转染细胞,检测不到病毒正、负链RNA与蛋白表达。以上结果说明HCV1b型5'UTR与3'UTR可以支持1a型病毒RNA的正常复制,3'UTR保守区的存在与否,对病毒复制影响不大。     

利用昆虫病毒系统生产表达胰岛素的腺相关病毒

腺相关病毒(Adeno-associated virus-2,AAV-2)用于构建基因治疗病毒载体,在基因治疗领域受到了普遍重视和关注,而rAAV在应用过程中一个很重要的限制因素就是缺乏简单有效的大规模制备方法.运用昆虫细胞表达系统来提高AAV-2的产量,分别采用绿色荧光蛋白(GFP)和胰岛素(Insulin)基因替代AAV-2的结构基因后,与其他重组病毒共转染293t细胞,3 d后即可检测到高效表达的GFP和Insulin.结果表明,该方法能够比较理想地提高AAV的产量,为临床使用奠定了基础.     

中药白头翁体外抗病毒作用

目的:研究白头翁不同极性的提取物对呼吸道合胞病毒(RSV)的体外抑制作用.并通过进一步分离纯化,为筛选抗RSV的有效单体做准备.方法:预实验分别以水、体积分数为75%乙醇、乙酸乙酯为溶剂进行粗提取药物.分别采用RSV-MA104、单纯疱疹Ⅰ型病毒(HSV-1)-MA104和肠道病毒71型(EV-71)-RD细胞感染模型进行病毒筛选,初步检测其体外具有抗RSV活性.根据预实验结果,再用水提醇沉法对白头翁水总提取物分离纯化,将其上清液和沉淀物分别进行体外抗病毒试验,再用大孔树脂吸附法提取白头翁的16个化学部位进行体外抗病毒试验,通过在显微镜下观察细胞病变效应(CPE),以酶标仪测定中性红染色后的A540值,计算其治疗指数(TI).结果:白头翁的水、乙醇、乙酸乙酯3种总提取物中水总提取物对呼吸道合胞病毒的抑制效果最好;再用水提醇沉法将白头翁水总提取物分离后,沉淀物的治疗指数TI97.01;白头翁大孔树脂水洗脱液2号具有显著的抗RSV活性,治疗指数TI112.99.结论:白头翁水部位具有良好的抗RSV活性.     

吖啶橙荧光染色法在遗传毒理学中的应用

本文用吖啶橙(Acridine orange)荧光染色法进行了遗传毒理的研究,并取得了较好的效果。实验内容包括:(1)中国仓鼠体外培养细胞的姐妹染色单体交换试验;(2)中国仓鼠活体中姐妹染色单体交换试验;(3)小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验;(4)孕鼠骨髓与胎鼠肝血微核试验。与Giemsa染色法相比,吖啶橙荧光染色法有染色特异性强、色泽鲜艳、重复性强、实验结果可靠等优点.