谷胱甘肽合成酶在大肠杆菌中的高效表达及性质

在成功构建了谷脱甘肽（ＧＳＨ）合成酶基因表达质料（ｐＴｒｃ－ｇｓｈ）的基础上,对不同大肠杆蓖突主菌进行了比较,筛选出高效、稳定表达ＧＳＨ合成酶的工程菌并进行了最佳酶表达条件的研究。结果表明：重组工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＴｒｃ－ｇｓｈ）表达量最高,质粒稳定性好;以５％接各量于３７℃、ｐＨ７．２培养至ＯＤ５５０＝０．５左右,加入诱导剂ＩＰＴＧ（０．ｍｍｏｌ／Ｌ）,同时切换培养条件为３４℃、ｐＨ６     

人粒细胞集落刺激因子在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿尺核型多角 体病带β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基因标志的非融合蛋白基因转移载体ｐＢＢ成功地构了重组杆状病毒ＡｃＮＰＶ－Ｇ－ＣＳＦ．在感染重组病毒的草地夜蛾细胞中ｈＧ－ＣＳＦ得到了高效表达。表达产物由ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检出，其分子量约为１９ＫＤａ。     

利用噬菌体T＿7RNA聚合酶在大肠杆菌（E．coli）中引导人尿激酶原克隆基因的表达

我们将人尿激酶原基因（ｐｒｏ－ＵＫ）重组到含Ｔ＿７基因１０启动子的质粒（ｐＥＴ３ｃ）中，用异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）的ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中进行表达。经纤维蛋白平板测活法测得表达产物存在于包含体中。经变性和复性处理后，表达量达每升培养液１６００ＩＵ．用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法鉴定表达产物为单一条带。分子量在４３ｋＤａ左右，略低于天然５４ｋＤａｐｒｏ－ＵＫ。这可能与Ｅ．ｃｏｌｉ中缺乏糖基化酶有关。     

用PCR法构建乳腺特异性表达非乳蛋白基因的研究

将ＰＣＲ法分别从绵羊和人血基因组ＤＮＡ中扩增出的绵羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５＇端调控区８９８ｂｐ的片段和人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４基因（ｈＣＤ１４）成熟肽１２４５ｂｐ的片段连接。连接片段插入ｐＵＣ１９ ＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ位点，构建成ｐＢＬＧ－ｈＣＤ１４质粒。该质粒经ＫｐｎＩ及ＣｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ酶切、ＰＣＲ法扩增ＢＬＧ和ｈＣＤ１４分析后，进一步用＾３２Ｐ－ＢＬＧ探针杂交确证。用Ｅｃ     

早熟禾的组织培养和基因枪介导的基因转化体系的初步建立

分析了不同质量浓度的２,４－二硝基苯酚对早熟禾愈伤组织诱导和愈伤组织分化成苗的影响,３ｍｇ／Ｌ和０．１ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ分别是本试验所用早熟禾基因型诱导形成愈伤组织和愈伤组织分化成勒的最适度量浓度。利用基因针ＧＵＳ基因的ｐＧＡ４７０和ｐＡｃｔ１－Ｄ质粒导入愈伤组织,通过组织染色法检测到Ｇｕｓ基因的瞬时表达。     

乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的组成型表达

以酵母载体ＹＦＤ５９为基础,将乙肝病毒表面抗原ＳＡ－２８融合基因正向插入组成型启动子ＰＰＧＫ１及终止子ＴＰＧＫ１间,得到表达载体ＹＦＤ５９－ＬＳＳ１。并将该表达载体分别转化ＢＪ２１６８,ＤＢＹ７４６,ＪＲＹ１８８,ＢＪ３５０５ ４株不同的酿酒酵母株。再将ＹＦＤ５９－ＬＳＳＩ质粒上的表达单元克隆至高稳定载体ｐＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点,构建成３个带有不同拷贝数和不同插入方向表达单元的表达载体;ｐＨＣ１     

藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达

用ＰＣＲ技术从层理鞭枝藻总ＤＮＡ中扩增藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的基因,将ｐｅｃＡ克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ;ｔ,然后将ｐｅｃＡ基因插入表达载体ｐＧＥＭＤ,形成的重组质粒在ＢＬ２１（ＤＥ３）中最高效表达,表达蛋白形成包涵体,高效表达的蛋白的分子量为１９×１０＾３,与藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的分子量一致,经Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ进一步证实该表达蛋白为藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白。     

转录因子E2F—1的DNA结合结构域与GST的融合表达和纯化

通过聚合酶链式反应方法扩增转录因子Ｅ２Ｆ－１中ＤＮＡ结合结构域的基因片段,并将其克隆到ｐＧＥＸ－２Ｔ表达载体中,转化ＢＬ２１菌株．经ＩＰＴＧ诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,其表达量达１５％．经ＧＳＴ－Ａｇａｒｏｓｅ亲合层析,目的蛋白得到了高度纯化．经胶迁移率改变实验（ｇｅｌｓｈｉｆｔｍｏｂｉｌｉｔｙａｓａｙ）证明目的蛋白具有与腺病毒Ｅ２启动子ＤＮＡ片段结合的能力．     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）在大肠杆菌中的表达,…

人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ重组在表达质粒ｐＤＲ７２０中。在Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００中获得了表达，表达水平为２％。以醋酸锌显色ＰＡＧＥ凝胶回收ｔ－ＰＡ表达条带，进行复性处理。复性产物经Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，Ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，纯化得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染一条带纯度，比活为４，０００ｍｏｌ／ｓ·ｇ的人ｔ－ＰＡ。     

T7启动子促发下的人尿激酶原在大肠杆菌中的高效表达

将人工全化学合成的尿激酶原（ｐｒｏ－ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＥＴ３ｄ中，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳ，经ＩＰＴＧ诱导，获得了占菌体总蛋白１８％的高表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定，表达产物主要为单链尿激酶，并且在菌体内基本以无活性的包涵体形式存在。经体外变复性，从ＩＬ培养基中可获得３０００００单位的活性尿激酶原。     

一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化

以E.coli AB90054基因组中DNA为模板,采用PCR方法扩增得到glyA基因,将该基因克隆到表达载体pET28a(+)中,转化表达菌株BL21(DE3)后筛选阳性重组子,并对筛选所得高表达基因工程菌G16进行培养条件和表达条件的优化。结果表明,当培养条件为38℃、pH为7.0、转速为150r/min时,基因工程菌的生长速度和菌液浓度最佳;当表达条件的诱导温度为30℃、诱导剂浓度为0.5mmol/L、诱导时间为5h时,基因工程菌诱导目的蛋白表达效果最好。通过SDS-PAGE分析和酶活测定后发现,在优化条件下基因工程菌G16发酵产丝氨酸羟甲基转移酶能力占菌体总蛋白的60%左右,且蛋白活性正常。     

大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达

为了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的结构和功能,采用PCR(聚合酶链式反应)、双酶切和细胞转化等基因工程方法对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因进行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达分析,扩增出一个新的大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因,将其基因克隆到原核表达载体pET-30a上,并导入到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。通过IPTG诱导成功表达出大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。所提出的方法能够高效表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,为进一步大规模表达纯化和应用提供参考。     

分子伴侣GroEL对青霉素G酰化酶亚基折叠的影响

采用Tac启动子控制表达质粒，在不同的宿主细胞中表达了青霉素G酰化酶（PAC），检测这些菌株所表达的PAC活性，分析细胞内分子伴侣GroEL含量，PAC翻译后加工为α，β亚基的状况，以及它们之间的关系，结果表明：质粒pKK-SP在不同宿主中表达时，翻译后加工状况有明显差异，单位质量细胞所表达的PAC活性与翻译后加工效率相关，且与细胞内分子伴侣GroEL在菌体总蛋白中含量正相关，同时也阐明了亚基的折叠成为翻译后加工过程的限制步骤，细胞内分子伴侣GroEL有助于PAC亚基的折叠和稳定。     

秀丽隐杆线虫胆固醇7,8-脱氢酶在大肠杆菌中的表达

胆固醇7,8–脱氢酶是参与胆固醇代谢的还原酶,可以将胆固醇转化为7–脱氢胆固醇(合成维生素D3的重要中间体).合成秀丽隐杆线虫的胆固醇7,8-脱氢酶基因daf-36,与具有T7强启动子的载体pET32a(+)连接后,成功构建pET32a-daf-36表达质粒,转入大肠杆菌表达系统E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta(DE3),经过IPTG诱导培养,蛋白质电泳图谱及质谱结果表明此酶得到了高效表达.     

青霉素G酰化酶调节基因定点诱变的研究

构建了大肠杆菌中青霉素G酰化酶（PAC）的调节基因（pacR）翻译起始密码定点突变株。对突变后PAC的表达调控特征进行了研究，结果表明：突变株的pac基因表达后能正常加工成24ku、65ku的α亚基和β亚基；突变后，虽然PAC表达仍需要苯乙酸诱导，但是，可诱导性提高，形成低组成型表达，无葡萄糖有分解代谢物阻遏效应，因而pacR对PAC表达水平存在着影响，pacR基因是葡萄糖以及它的分解代谢物在分子水平上影响PAC表达的另一作用因素。采用突变株进行发酵生产中，PAC产量较亲株提高3倍，而且可以采用葡萄糖作为碳源，有利于改善PAC的生产。     

枯草芽孢杆菌的ade基因在大肠杆菌中的MBP融合表达及活性鉴定

扩增了枯草芽孢杆菌的ade基因, 重组入载体pMal-c2x中, 构建了麦芽糖结合蛋白（MBP）融合蛋白的表达体系. 通过IPTG诱导表达, 用MBP亲和层析法, 纯化该融合蛋白（104 700）, 并通过SDS-PAGE对表达及纯化结果进行检验, 对其酶学性质进行了初步研 究. 分析结果表明: 该融合酶蛋白具有显著的腺嘌呤脱氨酶活性, 证明了ade基因是枯草芽孢杆菌中编码腺嘌呤脱氨酶的基因.     

脂肪酶产生菌的筛选及基因的克隆表达

目的筛选出脂肪酶活性较高菌株,通过脂肪酶基因克隆技术获得高表达的脂肪酶,根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.方法采用透明圈法,以三丁酸甘油酯为底物筛选脂肪酶活性较高菌株;通过PCR扩增获得其脂肪酶基因Pseudomonas peli(PP)序列,构建pET-28 a表达载体,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达;通过Ni柱将脂肪酶纯化,并根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.结果筛选到一株脂肪酶活性较高的菌株,16S rRNA基因序列比对结果初步鉴定为Pseudomonas peli.PCR扩增得到的基因片段长度为801 bp,其序列与Pseudomonas peli中的脂肪酶基因序列相似性达到100%,PP基因在大肠杆菌中异源表达蛋白的分子量约29 KD,该蛋白在55℃、pH 7.0时活性最高.结论通过基因克隆表达后得到的脂肪酶Ni柱纯化后纯度达95%以上,且耐高温,为脂肪酶工业化应用奠定了基础.     

纳豆激酶基因重组表达载体的构建及其稳定性

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的纳豆杆菌基因组DN中扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到表达载体PBV220上,筛选重组子,通过限制性内切酶和PCR技术分析,初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,用凝块溶解时间法（CLT）测出表达产物具有溶解血栓活性,证明该基因可在大肠杆菌中表达,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明质粒的插入对宿主菌的生长没有太大影响,该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,但结构稳定性较差,SDS-PAGE分析结果表明基因产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12%左右。     

水稻土壤宏基因组中的β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及酶活的研究

β-葡萄糖苷酶(Ec3.2.1.21)属于糖苷水解酶家族3,它能够水解非还原性末端的β-D葡萄糖苷键,释放出游离的葡萄糖及相应的配基。β-葡萄糖苷酶是纤维素降解中的关键酶,对于可再生资源纤维素的利用具有十分重要的意义。本研究从水稻土壤中分离得到β-葡萄糖苷酶基因pds5,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,转化BL21大肠杆菌中,并诱导表达该基因。重组BL21大肠杆菌用IPTG诱导后,所提取的酶蛋白具有β-葡萄糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其相对分子质量为83 kD。通过控制pH和温度的方法,测得该酶酶活最适pH为7.0,最适温度为37.5℃。     

丙烯酰CoA合成酶在大肠杆菌中的表达及其酶活性表征

以橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus）dsm636基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆了丙烯酰CoA合成酶（ACS）基因,并连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建了pET-22b(+)-Acs重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+) Acs转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建了大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-Acs基因工程菌。重组菌株经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,目标条带出现在分子量约160000处,表明丙烯酰CoA合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达;体外酶活实验证明,所表达的丙烯酰CoA合成酶是具有活性的。