哺乳藏猪肠道CAT1、EAAC1和Pept1 mRNA的发育性表达分析

选取体重接近且健康的哺乳藏猪30头,其中1、7、14、21和28日龄各6头,运用实时定量PCR对Pept1、EAAC1、CAT1 mRNA表达的发育性变化进行研究。结果表明,在十二指肠中藏猪CAT1、Pept1 mRNA表达的发育性变化相似,14日龄时表达丰度最高;EAAC1、CAT1 mRNA在空肠中表达的发育性变化相似,CAT1在21日龄达到最高点,但与其他日龄相比差异不显著;回肠中Pept1与EAAC1 mRNA表达丰度具有相似的发育性变化,7日龄回肠Pept1 mRNA表达量最高,显著高于其他各发育阶段(P0.05)。     

藏猪肠道不同部位CAT1、EAAC1和PepT1 mRNA的特异性分布

选取体重接近且健康的28日龄哺乳仔藏猪6头,屠宰后分离肠道(十二指肠、空肠前段、空肠后段和回肠),运用RFQ-PCR技术对藏猪不同肠段小肽转运载体PepT1、酸性氨基酸转运载体EAAC1和碱性氨基酸转运载体CAT1 mRNA的组织分布进行研究.结果表明:空肠后段PepT1 mRNA表达丰度最高,而回肠的表达量最低;从小肠近端到远端EAAC1 mRNA的表达丰度在小肠的表达呈升高趋势,即回肠表达最高,空肠后段次之,但与十二指肠、空肠前段差异不显著(P>0.05);CAT1 mRNA不同肠段表达格局与EAAC1相似,回肠中CAT1 mRNA表达丰度最高,显著高于十二指肠(P<0.05),但空肠前、后段的差异不显著(P>0.05).     

实时荧光定量PCR检测疫霉侵染下辣椒ERF基因的差异表达

本研究利用real-time荧光定量PCR技术检测辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici.)胁迫下辣椒抗病基因ERF的mRNA转录水平变化.结果表明:与对照相比,疫霉侵染下辣椒ERF基因的表达量随着胁迫时间延长呈现出先升高后降低的变化特点,该基因在早期被诱导表达,在胁迫6h后表达量达到最大值,之后逐渐下降...     

红细胞CR1数量表达和基因多态性的研究

红细胞补体受体I（CR1）是红细胞重要的免疫物质基础,红细胞的一个功能是通过CR1促进免疫复合物由循环中完全清除.红细胞免疫黏附能力与CR1数量表达有关,CR1的基因突变影响数量表达.许多疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、慢性肝炎及肿瘤中红细胞CR1水平下降,与CR1分子的数量及基因多态性密切相关.     

木茼蒿SOC1同源基因的克隆及表达分析

SOC1基因是整合各种成花途径信号,启动植物成花转变的关键基因之一.以木茼蒿为材料,利用RT-PCR技术,克隆了木茼蒿SOC1同源基因AfSOC1;利用qRT PCR技术,对其时空表达模式进行了分析.结果表明:木茼蒿AfSOC1 cDNA长为648 bp,编码216个氨基酸,与拟南芥SOC1和金鱼草DEFH68的同源性...     

应用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数的新方法

介绍一种采用实时荧光定量PCR法鉴定重组细胞株基因组中外源基因拷贝数的方法.首先根据研究对象建立标准品,以拟检测的外源基因设计特定的引物,得出标准曲线,然后在不同重组细胞株中对外源基因进行Real-Time PCR鉴定,根据结果与标准品比对得出实际的拷贝数.结果表明:以转染sPDGFRα基因的重组CHO-K1细胞为例,采用该方法,利用标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系,并且具有较大的线性范围(101-105拷贝);测得各重组细胞株外源基因拷贝数不同,3次独立实验表明结果一致.与传统杂交技术鉴定转基因拷贝数相比,该方法具有高效省时、更稳定、高通量和低成本等优点.     

泛素和PR1a信号肽融合基因植物表达载体的构建

泛素（Ubiquitin）融合蛋白策略在近年来已被应用于在植物中提高外源蛋白的产量。信号肽（Signal Peptide）使外源蛋白定向运输到细胞内的特定部位。本研究是在植物高效表达载体pBin438的基础上,采用三引物PCR法（TP-PCR）技术,将拟南芥（Ambidopsis）泛素基因与烟草病程相关蛋白PR1a基因的信号肽序列体外重组;并将重组的融合基因定向克隆到植物表达载体pBLG中,获得了含有泛素和PR1a信号肽序列的植物表达载体pBLG-UP。这为进一步验证外源基因在植物体内的高效表达奠定了基础。     

rcan1-1l基因的克隆和表达

从小鼠脑组织中通过总mRNA的提取、RT-PCR方法,利用pEASY-T1载体克隆出了鼠源rcan1-1l基因,并构建出了重组有rcan1-1l基因的PET21a原核表达质粒,进行了表达条件的初步摸索,这为今后研究rcan1-1l基因以及蛋白的结构与功能打下了前期实验基础.     

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出核苷酸数大约1.5k的片段，PCR产物经回收后，与PCAMBIAI303载体连接并转化大肠杆菌DH5a，阳性重组子经PCR鉴定，结果表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体。     

人GABRA1实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

根据GenBank上人GABRA1基因的序列,设计并合成特异性的引物及探针,采用TaqMan探针法建立了荧光定量PCR法,以常规PCR产物为标准品,建立标准曲线．结果表明,标准曲线Ct值检测范围为12．07-32．72,相关系数为0．999,扩增效率为96．4%.建立的GABRA1TaqMan探针实时荧光定量方法具有线性范围广、扩增效率高、检测时间短、敏感性高等特点．     

半定量RT-PCR法在检测基因表达水平中的应用

半定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR法)是近年来常用的一种快速、简捷、特异的RNA检测方法,也是探讨基因转录水平的有效手段.该文就半定量RT-PCR法的检测步骤及技术的关键因素(总RNA提取、引物设计、循环数的确定和内参的选择等)进行综述.     

人白细胞介素-15表达菌株的构建

从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出白细胞介素15(IL-15)基因.构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒(pET28c(+)-IL-15)含有IL-15基因.经Western blot鉴定证实为IL-15,并实现了在大肠杆菌中的高效表达.表达产物占菌体总蛋白的32%,从而为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用奠定了基础.     

小鼠肝炎病毒核酸快速检测方法的建立和应用

摘要: 为满足口岸对入境噬齿类动物快速检疫的需要,建立小鼠肝炎病毒( Mouse hepatitis virus,MHV) 快速核酸检测方法。方法使用引物和TaqMan 荧光探针设计软件,针对MHV 保守基因设计引物和探针,建立了RT-PCR 和Real-time RT-PCR 方法检测噬齿类动物临床样本中MHV 的方法。结果本研究建立的RT-PCR 和Real-time RTPCR检测MHV 方法具有良好的特异性和敏感性,通过将建立的方法应用于MHV 阳性鼠临床样品的检测,证实两种MHV 核酸检测方法具有良好的稳定性。结论本研究建立的RT-PCR 和Real-time RT-PCR 检测MHV 的方法,适用于动物粪便、尿液等易于获得样本的检测。     

RT-PCR法检测大鼠组织中GLUT8基因表达特异性

采用半定量RT_PCR技术检测青春前期和成年大鼠的主要组织中GLUT8基因mRNA表达水平.实验结果显示,葡萄糖转运蛋白GLUT8基因在成年和青春前期大鼠的睾丸组织中都有高度表达,在心脏和肾脏组织中有少量表达,在肝、脾等组织中的表达是微量的;在成年大鼠睾丸组织中,Leydig细胞、睾丸生精细胞以及附睾的精子细胞中GLUT8基因都有大量的表达,其中以在Leydig细胞中的表达最丰富,而且GLUT8基因在睾丸生精细胞中的表达水平高于附睾的精子细胞.结果说明GLUT8蛋白主要分布在大鼠睾丸组织中,并且主要在Leydig细胞和精子细胞中参与葡萄糖转运和能量代谢与供应.     

家猪STAT1的基因克隆、剪接变体鉴定及组织表达研究

以长白猪(Landrace)cDNA为模板, 克隆STAT1基因cDNA全长.家猪STAT1基因cDNA全长编码757个氨基酸的前体蛋白, 与人、大鼠、小鼠、牛等哺乳动物的STAT1氨基酸序列一致性分别为95％、908％、896％、916％; 同时, 本研究亦鉴定到家猪STAT1的3种剪接变体(分别命名为STAT1 sv1, STAT1 sv2, 和STAT1 sv3).采用RT PCR方法, 进一步检测了STAT1及其3种剪接变体在成年家猪各组织中的表达情况.STAT1和两种剪切变体(STAT1 sv2 和STAT1 sv3)在家猪组织中广泛表达, 而剪接变体STAT1 sv1则在肺和脾脏中有较高表达水平.     

血管生成抑制因子canstatin基因的克隆及表达

Canstatin是最近发现的能抑制新生血管生成和肿瘤生长的又一血管生成抑制因子。从胎盘组织中提取总RNA,根据已知canstatin基因序列,设计特异引物,应用RT－PCR方法扩增出该基因片段。DNA序列测定表明,与文献报道的该基因比较,核苷酸序列完全一致。将扩增得到的该基因克隆于原核表达载体pPROEX-HTb中,在大肠杆菌E;coli BL21中经IPTG诱导获得了表达,表达量约占菌体总蛋白量的20％以上。     

藏鸡源乳酸菌的筛选鉴定及IBV N基因的表达研究

从藏鸡(海拔3000米藏区、自然放养、未使用过抗生素)肠道内筛选乳杆菌, 经16s rDNA和生理生化试验鉴定为植物乳杆菌.通过耐酸耐胆汁试验和肠道黏附试验测试, 表明其具有良好的耐酸耐胆汁能力和肠道黏附能力.为使外源质粒顺利转化入乳杆菌, 进行电场强度的优化, 再按照优化后的电场强度, 将禽冠状病毒pSIP409 N重组质粒电转化入该株乳杆菌, 进行双酶切和PCR鉴定.将经鉴定成功转入的重组乳杆菌, 用诱导肽SppIP诱导表达, 再进行SDS PAGE检测外源蛋白的表达.结果表明N蛋白能够顺利表达. 上述试验证明该株植物乳杆菌具有作为乳酸菌活载体疫苗的潜力.     

非结构蛋白NS1-ELISA检测禽流感野毒感染抗体

利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol／I的IPTG诱导表达5 h,经15％的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的 NS1融合蛋白,且以包涵体的形式存在,NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化或用尿素变性复性,获得纯度较高的NS1蛋白,并以此为抗原,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法。最佳包被浓度为2．5μg／ml,血清的最佳稀释倍数为1:200, 酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5 000。重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应。分别检测H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗和H9N2纯化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分别为0．225、0．210、0．205和0．184．均为阴性;而对H9N2和H5N2亚型活毒感染10-15 d的血清进行检测,各5份,其平均OD490值分别为0．610和0．619,均为阳性。因此,NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,可作为一种鉴别诊断标记,但不能区分亚型．具有A型特异性。NS1-ELISA 方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。     

猪Akt1、Akt2基因克隆与组织表达图谱分析

为了得到长白猪蛋白激酶Akt1和Akt2基因序列并分析其表达模式,本研究使用RT-PCR方法,首先克隆了蛋白激酶Akt1和Akt2的cDNA.序列分析显示:长白猪Akt1基因的cDNA全长1461bp,编码具480个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠同源性达到97%以上.长白猪Akt2基因cDNA全长为1505bp,编码具481个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠的同源性高达97%以上.SMART分析表明,猪Akt1和Akt2蛋白均包含了与PI-3K结合的PH结构域及2个具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域.RT-PCR检测结果显示:Akt1mRNA在垂体、心脏、肝脏、脾脏、肌肉组织中高表达,在大脑、小脑、肾脏表达丰度较低.Akt2则在小脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏和肌肉组织中高表达,而在大脑和肾脏中表达丰度较低.