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1.
正构建黏蛋白1基因敲除小鼠模型黏蛋白1(MUC1)属黏蛋白家族成员,分布于上皮细胞膜表面,由于在免疫炎症反应以及肿瘤发生中的重要作用而日益受到重视。上海交通大学程布凯等为了进一步深入研究MUC1的生物学功能,构建了Muc1基因敲除小鼠模型。研究人员首先根据小鼠Muc1基因组序列设计基因剔除策略,将2个loxP位点分别插在外显子2和3两侧,构建基因剔除载体Muc1-ABRLFnpBR322。以电穿孔方法将载体导入胚胎干细胞(ES细胞),用G418和更昔洛韦进行正负筛选获得4个同源重组的ES细胞克隆。挑选其中一个阳性ES克隆行囊胚显微注射,获得16只嵌合率大于50%的雄鼠;其次,利用嵌合雄鼠与C57BL/6J野生型雌鼠交配后获得11只floxP杂合子小鼠(10雄1雌),通过杂合子小鼠回交,并进一步与EIIa-Cre小鼠交配,最终成功得到Muc1全身敲除小鼠,其中纯合子小鼠未  相似文献   

2.
目的构建基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究。方法首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用正负法筛选阳性ES细胞,通过PCR、Southern鉴定后,将正确重组hRas基因的ES细胞导入C57BL/6 J小鼠囊胚,移入同步发育的受体鼠子宫,妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠。再将杂合子hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasfl/fi,然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg(EIIa-cre)小鼠进行交配,获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平。结果成功构建了基于Cre-LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体,筛选得到的一个正确克隆,电转ES细胞后进行Southern blot鉴定,经过初筛和复筛,共获得12个阳性克隆,挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射,移植了48枚胚胎,出生9只小鼠,其中6只为嵌合鼠,将嵌合率50%的雄鼠与野生型C57BL/6 J雌鼠进行交配,出生21只后代,其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠;hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠,其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠;hRasfl/fl小鼠与Tg(EIIa-cre)工具鼠交配6次,未有仔鼠出生;跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现,E10.5~15.5 d胚胎中检测到hRas基因表达。结论成功建立运用Cre-LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl,未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲入小鼠模型做好技术储备。  相似文献   

3.
建立Ankle2基因敲除小鼠模型,为研究该基因在小鼠体内所发挥的重要生理功能提供基础. 本实验利用条件性基因敲除技术,进行打靶载体的设计与构建.将LoxP1st插入到Ankle2基因的第二内含子里,在第五内含子里插入FRT-neo-FRT-LoxP 元件,利用限制性内切酶DNA 及Southern blot 筛选出中靶ES 细胞克隆,随后将发生同源重组的ES细胞注射进C57BL/6J小鼠囊胚中,移入受体小鼠子宫,将得到的嵌合体雄鼠与C57BL/6J雌鼠交配获得Ankle2-Floxed 小鼠. 随后将Ankle2-Floxed 小鼠与全身表达FLP 酶的小鼠进行杂交,将打靶载体中的Neo基因去除,获得F1 代小鼠,F1 代小鼠自交并经PCR 鉴定筛选出Ankle2flox/flox小鼠.Ankle2flox/flox小鼠与全身或组织特异性表达Cre酶小鼠进行杂交,得到Ankle2基因杂合敲出小鼠,该小鼠自交,可获得Ankle2基因纯合敲除的小鼠模型. 该模型为深入研究Ankle2 基因在胚胎发育和衰老发生等中的调控功能提供材料和思路.  相似文献   

4.
以前的研究显示Smad3基因剔除 (Smad3ex8 ex8)导致小鼠发生渐进性的白细胞增多症、牙周炎、胃炎、肠炎以及粘膜表面附近脓肿形成的慢性感染。对有症状的Smad3ex8 ex8小鼠淋巴结的组织学及免疫表型分析显示T细胞有增强的增殖能力及活化的表型。进一步的研究表明Smad3ex8 ex8小鼠胸腺细胞及外周T细胞彻底失去了对TGF β的应答。此外 ,Smad3ex8 ex8突变纯合子小鼠还表现出典型的骨关节炎、骨质疏松和创伤愈合速度加快表型。因此 ,Smad3ex8 ex8突变纯合子小鼠有可能作为研究粘膜免疫缺陷和骨性关节炎等疾病发生的分子机制的模型动物 ,为了…  相似文献   

5.
目的繁殖和鉴定PAX-8基因敲除小鼠。方法将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型,提取每种基因型小鼠尾部基因组DNA,用PCR法进行鉴定,将其雄性杂合子与雌性杂合子交配,依照孟德尔遗传定律就有可能获得较多的基因敲除纯合子小鼠。结果PAX-8杂合子小鼠的繁殖和饲养均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得PAX-8基因敲除纯合子小鼠的有效途径。  相似文献   

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7.
NMR1系雄性小鼠被用来研究肺微粒体细胞色素P450家族中一个同功基因CYPlAl在香烟烟雾的诱导下表达.双轮回‘聚合酶链式反应’(PCR)和‘反向转录酶-聚合酶链式反应’(RT-PCR)被用来检测基因CYP1Al的转录水平.代表CYPlAl蛋白活性的7-乙氧基试卤灵-0-去乙基酶(EROD)的活性被用来检测基因CYPlAl的表达.双轮回‘聚合酶链式反应’(PCR)和‘反向转录酶-聚合酶链式反应’(RT-PCR)被用来检测基因CYPlAl的转录水平.测试结果表明在吸入香烟烟雾的情况下。小鼠肺微粒体EROD的活性和基因CYPlAl的转录水平是同步增加的.这个结果不同于以前在同样实验条件的一个自相矛盾的结果,即在CYPlAl蛋白增加时,基因CYPlAl的转录水平却是下降或不变.这说明本文所使用的方法可能要优于以前的实验方法.  相似文献   

8.
目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建靶向小鼠CREPT基因的敲除质粒。方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则靶向小鼠CREPT基因的sgRNAs,与体外转录载体pUC57-sgRNA连接,构建CREPT基因敲除质粒;体外切割实验验证设计的sgRNAs是否具有活性。结果 设计了3条sgRNAs并分别准确插入pUC57-sgRNA载体;体外切割实验结果显示,以上3条sgRNAs均能够介导Cas9蛋白对靶片断进行切割。结论 制备了小鼠CREPT基因敲除质粒和体外转录的sgRNAs,为构建CREPT基因敲除小鼠模型奠定了重要基础。  相似文献   

9.
BCR/ABL和SEA双基因重组载体的构建和表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:构建和表达含BCR/ABL融合基因和葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核双表达质粒.方法:利用RT-PCR技术从K562细胞中扩增出含BCR/ABL融合位点基因片段,提取金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增出SEA基因,分别将两基因片段连在pIRES载体的多克隆位点A和B上,构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA- pIRES-BCR/ABL重组质粒.将重组质粒转染K293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒在真核细胞的转录情况, SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白在真核细胞的表达.结果:成功扩增出BCR/ABL和 SEA基因片段;双酶切鉴定BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL重组质粒中含有BCR/ABL和SEA基因,测序证实完全正确;将重组质粒转染K293细胞后,经 RT-PCR扩增鉴定,插入到重组质粒的BCR/ABL和SEA基因能在真核细胞正常转录,经SDS-PAGE电泳鉴定重组质粒能够在真核细胞中表达BCR/ABL和SEA蛋白.结论:成功构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL真核双表达质粒,可在真核细胞中正常转录并表达BCR/ABL和SEA蛋白.  相似文献   

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