拟南芥突变体lac8-2和lac8-3的鉴定

本课题组已通过基因工程方法证实,拟南芥At5g01040的编码蛋白Lac8具有漆酶活性.本研究通过PCR扩增技术,成功筛选出Lac8基因的T-DNA插入突变体lac8-2和lac8-3的纯合子.RT-PCR分析表明,突变体中没有Lac8基因的表达.因此,lac8-2和lac8-3均可作为Lac8基因的功能缺失突变体,这为进一步研究Lac8基因在拟南芥生长发育中的功能奠定了材料基础.     

拟南芥ein2-1突变体对盐胁迫的响应

以拟南芥突变体ein2-1为材料,研究了其抗逆特性.基于发芽和根生长分析,发现拟南芥突变体ein2-1对盐胁迫高度敏感,此外,拟南芥ein2-1突变体对渗透胁迫和脱落酸也表现为高度敏感;结果表明EIN2基因参与了盐胁迫响应的调节.     

拟南芥RING finger结构域ABRv1基因的功能初步研究

拟南芥ABscisic acid responsive RING-v protein 1基因（ABRv1）编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶。为了分析ABRv1的基因功能,我们首先构建了高表达载体pBI121- ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1。通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T –DNA插入突变体abrv1。对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,检测其萌发率、气孔关闭情况进行,发现ABA处理后突变体的萌发率降低,过表达株系萌发率升高;突变体株系气孔几乎未关闭,过表达株系气孔关闭非常明显。以上结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用,为深入分析该基因的功能打下基础。     

拟南芥一氧化氮相关突变体在干旱胁迫下抗旱相关基因表达的研究

据报道,拟南芥一氧化氮（nitric oxide,NO）合成缺陷突变体noa1较野生型Col-0抗旱,而个别抗旱相关基因表达的增强是其抗旱机理之一.为了证实该结果及研究NO信号分子在抗旱中的作用,系统地对8种共12个不同类型的抗旱相关基因在干旱处理不同时间的拟南芥野生型和noa1及亚硝基谷胱甘肽还原酶功能缺失突变体gsnor1-3间的表达情况进行了反转录PCR分析.研究结果表明,抗旱相关基因的表达在拟南芥不同基因型间无明显差异,noa1的耐旱性与抗旱相关基因的表达无显著相关性.     

一株拟南芥晚花突变体的分子分析

植物的开花时间直接控制植物营养生长期和生育期的长短,在相当程度上决定着繁育的成功与否,也与植物的产量和质量性状密切相关.拟南芥花期改变突变体是植物开花调控机制研究重要的植物材料.研究利用前期研究中获得的一株稳定遗传的、晚花表型的T-DNA插入拟南芥突变体pex2为材料,对其进行开花相关表型分析、T-DNA插入位点鉴定及插入位点基因转录分析等研究,结果表明:pex2突变体中存在单一的T-DNA插入,该插入位点位于PEX2基因下游约1 800 bp处,且该位点的插入引起了PEX2全长转录产物的缺失.该研究为进一步探索pex2突变体晚花机制及拟南芥PEX2基因与晚花表型之间的相关性研究,提供了研究材料.     

一种适用于批量筛选和鉴定拟南芥突变体的快速DNA提取方法

DNA提取是拟南芥突变体筛选与鉴定中的关键环节.结合拟南芥突变体鉴定特点和DNA提取特点,对传统SDS法进行改良,摸索出一种简易、快速且经济的DNA提取方法,并将其应用到突变体的批量筛选与鉴定中.使用该方法可在常温下利用10mg左右拟南芥叶片,以少量试剂,通过简单的研磨、离心、沉降和干燥等步骤便能快速制备用于PCR检测的DNA模板.采用本方法个人提取单个样品DNA仅需15min左右,每小时可提取48个DNA样品.研究采用该方法提取了一批待鉴定拟南芥突变体的DNA样品,利用三引物法对其进行PCR检测,结果表明DNA样品浓度高,DNA扩增成功率高达100%,且目的条带清晰,说明该方法在拟南芥突变体的筛选和鉴定上是适用且高效的,可广泛应用于实验室突变体库的建立.     

拟南芥盐敏感突变体EMS85的快速基因定位与分析

土壤盐碱化是造成农作物减产的主要原因.作者通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型种子Col-0进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变,筛选到1株盐敏感突变体EMS85.通过杂交和后代性状分离比确定该突变体的不耐盐性是受隐性单基因控制.采用图位克隆的方法,通过对拟南芥5条染色体上的SSLP标记的筛选,挑选了24对均匀分布于染色体上的SSLP标记作为基因初定位,同时设计了一系列精细定位分子标记,通过粗定位和精细定位发现,该基因位于拟南芥第5条染色体下臂的分子标记LUGSSLP847和5-13.58之间,进而测序结果表明该突变体是SOS2基因的等位突变体,突变位点为该基因1 521~1 522 bp处两碱基的缺失,造成移码突变,使SOS2基因功能丧失.本实验室建立的图位克隆体系加快了克隆基因的进程,对EMS85突变体的定位只在短短半年时间就已完成,为其他突变体的快速确定候选基因,加速基因分离进程奠定了基础.     

拟南芥RING finger结构域AtHHR1基因的功能初步研究

为了研究拟南芥基因AtHHR1(编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶)是否参与热胁迫响应,构建了athhr1/AtHHR1互补转基因株系.对突变体、互补株系及野生型进行热胁迫处理,发现突变体的萌发率、叶绿素及脯氨酸含量高于野生型,而互补株系均低于野生型.通过real-time PCR定量检测发现,热诱导后拟南芥热信号通路中相关热激蛋白基因在突变体中表达比野生型中高.研究结果初步表明AtHHR1基因在拟南芥的热胁迫响应中起负调控作用.     

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。     

拟南芥中一个参与盐胁迫应答基因的T-DNA插入纯合突变体的鉴定及表型分析

本研究以拟南芥为试验材料,探索基因at5g66070在受到非生物胁迫的表达情况,并研究其抗逆特性.结果表明,在NaCl处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到盐的诱导.通过PCR和RT-PCR在DNA和RNA水平上筛选鉴定at5g66070基因T-DNA插入纯合突变体.分析了野生型拟南芥与突变体在不同浓度NaCl处理下,其萌发率,根长以及苗期的生长差异.结果发现,相对于野生型来说,突变体对盐更敏感.具体来说,在含有150mMNaCl的MS培养基中,突变体的萌发率比野生型要低,根长比野生型要短,同时突变体幼苗更容易出现枯萎,萎黄症状.     

拟南芥抗旱突变体的筛选和鉴定

文章采用不同浓度的甘露醇模拟干旱胁迫,以发芽率为筛选指标在拟南芥突变体库中筛选抗旱突变体,筛选出2株候选突变体,最终得到1株稳定突变体vem1,通过表型和生理生化鉴定,确定为抗旱突变体。该研究为抗旱基因克隆及功能分析奠定基础,对于揭示植物抗旱的分子机理具有重要的理论意义。     

Expression pattern of GASA,downstream genes of DELLA,in Arabidopsis

Separation and functional research of related components involved in gibberellins （GAs） signaling are important to clarify the mechanism of GA functioning. Research on the downstream components of DELLA, the key factor of the GA signaling pathway, is limited at present. GASA （GA-Stimulated in Arabidopsis） family contains 15 genes usually regulated by GA in Arabidopsis thaliana. All GASA proteins have a cleavable signal peptide in N terminus and a conserved GASA domain including 12 cysteines in C terminus. RT-PCR analysis revealed that the expression of GASA4 and GASA6 were down-regulated, but GASA 1 and GASA9 were up-regulated in the DELLA mutants, gai-t6 and rga-24, as well as the double mutant, consisting with the results that GASA4 and GASA6 were induced, but GASA1 and GASA9 were inhibited by exogenous GA3. In addition, the expression patterns of other GASA genes were regulated by GA and ABA, separately or cooperatively. Most of GASA genes were expressed in roots, stems, leaves, flowers and developing siliques. GUS gene driven by the promoters of GASA6, GASA7, GASA8, GASA9, GASAIO, GASA11 and GASA12were used as reporters and it was found that all GASA genes expressed in the growing and differentiating organs and abscission zones, suggesting the role of these genes in cell growth and differentiation. This study provided an important basis for functional study of the GASA gene family in the GA and ABA signaling pathway.     

UV-B预处理对拟南芥uvr8-2突变体响应干旱胁迫的影响

以拟南芥uvr8-2突变体植株为材料,研究UV-B预处理对植株响应干旱胁迫的影响以及植物激素在此过程中的作用.实验结果表明:从形态观察到生理指标,UV-B预处理显著提高了拟南芥uvr8-2突变体的干旱适应性,与野生型Ler的结果一致;UV-B预处理显著提高了拟南芥uvr8-2突变体抗氧化酶SOD、POD、CAT活性,抗氧化酶基因POD和CAT的表达量,以及植物激素ABA、JA、SA的质量分数,降低了细胞膜受损程度.由此推测:UV-B预处理诱导uvr8-2植株的干旱适应性中存在一条不依赖于UVR8的信号转导途径,即通过增加植物逆境响应激素ABA、JA和SA的质量分数,调控抗氧化酶基因CAT和POD表达和增强抗氧化酶活性,从而缓解干旱胁迫下拟南芥的叶片萎焉、相对含水量下降等现象.     

拟南芥转or基因突变体转录组及表型分析

构建了拟南芥orange(or)过表达突变体和相应的对照组,通过比较它们在色素含量、转录组、表型等方面的变化,发现or在绿色组织(拟南芥叶子、茎等)中也能起到提高类胡萝卜素含量的作用,且突变体类胡萝卜素合成途径的基因转录水平没有显著变化,但是很多防卫胁迫相关基因转录水平上调,说明突变体中存在胁迫环境.对不同生长条件下突变体幼苗下胚轴的测量等表明or突变体对光尤其是蓝光变得十分敏感.本研究分析比较了or在不同组织中的效应,为or应用于改良作物类胡萝卜素含量的基因工程和进一步揭示or的作用机制提供了参考.     

拟南芥外源ERG基因的阳性苗的初步筛选

近来关于Era蛋白(E.coli ras-like protein)及其同源蛋白的研究较多,但其在真核生物中的功能仍不明朗,尤其是植物中相关研究报道尚少。拟南芥中有两个ERG蛋白,大小分别为437个氨基酸和427个氨基酸,分别用ERG437和ERG427表示。本文通过构建ERG基因的真核表达载体,利用农杆菌浸花法侵染拟南芥植株,筛选出阳性植株,为进一步定位观察和功能研究提供了材料。     

Characterization of Arabidopsis calreticulin mutants in response to calcium and salinity stresses

As an important calcium-binding protein,calreticulin plays an important role in regulating calcium homeostasis in endoplasmic reticulum (ER) of plants.Here,we identified three loss-of-function mutants ofcalreticulin genes in Arabidopsis to demonstrate the function of calreticulin in response to calcium and salinity stresses.There are three genes encoding calreticulin in Arabidopsis,and they are named AtCRT1,2,and 3,respectively.We found that both single mutant of crt3 and double mutant of crtl crt2 were more sensitive to low calcium environment than wild-type Arabidopsis.Moreover,crt3 mutant showed more sensitivity to salt treatment at germination stage,but tolerance to salt stress at later stage compared with wild-type plant.However,there was no obvious growth difference in the mutant crt1 and crt2 compared with wild-type Arabidopsis under calcium and salt stresses.These results suggest that calreticulin functions in plant responses to calcium and salt stresses.     

滞绿突变体的研究现状及应用前景

许多物种的滞绿突变体具有相似的表型特征,即衰老被延缓,叶绿素不降解或降解缓慢.但由于遗传背景不同,它们滞绿的分子机理相差很大.文中综述了滞绿突变体在生理生化(叶绿素的酶代谢途径)、遗传特征及分子生物学上的研究进展,介绍了滞绿突变体在植物叶绿素代谢、叶片衰老机制以及光合作用等生理过程基础研究中的重要性,并全面介绍了在农业生产的各个方面的应用前景及潜力,其中以能显著提高农作物抗逆性及产量的类型A和B的功能型滞绿突变最为重要,同时对滞绿的分子机理的研究使从根本上解决农作物早衰的问题成为可能.     

A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting

Photosynthetic light harvesting in plants is regulated in response to changes in incident light intensity. Absorption of light that exceeds a plant's capacity for fixation of CO2 results in thermal dissipation of excitation energy in the pigment antenna of photosystem II by a poorly understood mechanism. This regulatory process, termed nonphotochemical quenching, maintains the balance between dissipation and utilization of light energy to minimize generation of oxidizing molecules, thereby protecting the plant against photo-oxidative damage. To identify specific proteins that are involved in nonphotochemical quenching, we have isolated mutants of Arabidopsis thaliana that cannot dissipate excess absorbed light energy. Here we show that the gene encoding PsbS, an intrinsic chlorophyll-binding protein of photosystem II, is necessary for nonphotochemical quenching but not for efficient light harvesting and photosynthesis. These results indicate that PsbS may be the site for nonphotochemical quenching, a finding that has implications for the functional evolution of pigment-binding proteins.