酶体外定向进化(Ⅱ)文库筛选的方法及其应用

定向进化是改造蛋白质分子的一种有效的新策略,但其构建的文库非常大,待筛选的克隆常常多达10^5～10^10．同时在目的酶筛选中,至关重要的是找到高灵敏度、高选择性和高通量的筛选方法．居于此,文中综合评述在突变株分离、酶检测和信号探测等方面,目前的一些常用技术及其最新进展．     

酶体外定向进化(Ⅲ)展示技术及其应用

利用展示技术构建的蛋白质／多肽的突变体库，可以通过高通量进行高效地分析和筛选，因此特别适用于改造蛋白质．文中综述噬菌体、细胞表面、核糖体、mRNA等展示技术的原理和方法，以及其在酶定向进化中的应用．     

重组β-葡萄糖醛酸苷酶转化甘草酸的定向性改造

为提高重组β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性,通过易错PCR方法对其进行突变并构建突变体文库,利用薄层层析和高效液相色谱对突变文库进行筛选,获得了突变株PGUS（M51）E,其底物特异性提高了41％。突变酶的酶学特性研究发现,该突变酶的最适pH值和温度较PGUS-E无显著变化,酶活力下降了16．86％,T。值提高了5℃;序列分析结果表明：PGUS（M51）-E共发生5处突变,其中3处发生在糖基结合域。因此,利用定向进化策略能有效提高伊葡萄糖醛酸苷酶的底物识别特异性。     

利用EvolvR系统对酶基因实现多窗口定向进化的研究

定向进化包括随机基因文库生成、基因在合适宿主中的表达和筛选目标特性变体. EvolvR作为一种CRISPR介导的新型定向进化技术，可以使目标序列在一天内完成整个进化过程. 目前，EvolvR只报导用于抗性基因的突变，以及串联最多2个sgRNAs以扩大突变窗口长度. 本研究旨在探究EvolvR系统在酶基因序列定向进化中的适用性以及突变效率， 同时在此基础上扩大EvolvR的突变窗口长度. 该研究结果表明，将4个能高效表达的单个sgRNA 串联，成功检测到靶向同一基因的3个不同靶位点，证明了EvolvR具有在目标基因区域大范围制造突变的潜力，具有很高的应用价值. 本研究为利用EvolvR系统对目标酶基因实现定向进化的研究奠定了基础.     

人工酶与定向进化的前沿与挑战

 定向进化是在实验室环境中，在分子水平上模拟进化过程，得到具有期望特征的蛋白质的方法，目前已成为蛋白质设计改造的重要方法。定向进化不仅可以用于天然蛋白质的改造，也可以通过改造现有的酶，使其具有新的催化活性，从而构建人工酶。本文重点介绍工业生物催化、纳米酶设计和光催化3个方向的前沿成果，并讨论人工酶与定向进化领域存在的挑战和问题。     

构建突变基因文库的定向进化研究进展

1.介绍定向分子进化是在实验室条件下模拟自然选择过程,改变原有蛋白的氨基酸序列,以期找寻预期性能的突变蛋白。定向分子进化实验的成功与否取决于制备的突变体库的质量和简捷、高效的筛选方法。随着体外定向进化分子改造新策略的不断涌现,以及相关领域如生物信息学、功能基因组学、功能蛋白质组学等的更新和完善,各种基因改组技术的应用正受到足够的重视。其中,酶工程的定向进化已为基因     

采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化

以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变.     

SSR标记分离技术的研究概况

SSR标记是植物中目前运用的最广泛的分子标记之一，广泛地运用于植物种质鉴定、分子标记连锁图的构建和群体遗传学等诸多领域．由于SSR为共显性标记，可以区分纯合、杂合基因型，因而得到更广泛的应用．目前出现了有筛选文库、筛选富集文库、与其他现有技术结合、STMP技术等SSR标记方法．在这些技术中，目前运用最广泛而且比较成熟的方法是筛选富集文库的方法，STMP技术是目前效率最高的分离单个微卫星位点的方法，可以开发SSR标记．本文对这些技术的原理作了论述．     

易错PCR法定向进化D-海因酶的初步研究

D-海因酶是生物转化D-型氨基酸的关键酶,在一定浓度M n2 存在下,经易错PCR法重复扩增,产物构建成pET-HDT重组子,并建立突变体文库.经筛选获得了内源DNA序列变异的变异株.进化酶催化底物海因水解的活性为亲本重组酶的1.3倍,催化底物对羟基苯海因水解的活性为亲本重组酶的2.4倍.     

体外定向分子进化的新策略及新应用

体外定向分子进化是发现和改造生物活性分子的重要方法,提供了一种高效的获得多样性的方法。DNA改组(DNA shuffling)是重要的体外分子进化技术,结合高通量筛选能够改造许多重要的医药、工业、环境保护等方面的商业酶。近年来,许多体外分子进化的新策略和新方法层出不穷,得到了良好的发展和应用,其中有代表性的11种是DNA家族改组(DNA family shuffling),部分基因片段改组、单链DNA家族改组(SSDNAs)、简并引物基因改组(DOGS)、基因组改组(Genome Shuffling)、瞬时模板的随机嵌合(RACHITT)、单向引物的随机重组(MURA)、自我复制(CSR)改组、易错环行扩增(error-prone RCA)、基于遗传密码随机切除(COBARDE)、核酸内切酶V(endonuclease V)替代核酸内切酶DNaseI等。     

多肽的表面展示与结构库

表面展示是一种新的基因操作技术,它使表达的多肽以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞表面,保持相对独立的空间结构和生物活性。该技术可用于研究多肽(蛋白质)的性质、相互识别和作用,并据此从巨大展示库中选择特定靶功能的多肽结构。常用丝状噬菌体、T₄噬菌体、λ噬菌体以及细胞构建表面展示系统。表面展示库包括重组噬菌体抗体库、随机短肽库、多肽构象库、cDNA展示库和基因突变体展示库。表面展示技术可用于人工抗体和疫苗的制备、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离、细胞表面工程的研究、多肽药物的研制,以及生物分子实验定向进化等研究。     

Selection and evolution of enzymes from a partially randomized non-catalytic scaffold

Enzymes are exceptional catalysts that facilitate a wide variety of reactions under mild conditions, achieving high rate-enhancements with excellent chemo-, regio- and stereoselectivities. There is considerable interest in developing new enzymes for the synthesis of chemicals and pharmaceuticals and as tools for molecular biology. Methods have been developed for modifying and improving existing enzymes through screening, selection and directed evolution. However, the design and evolution of truly novel enzymes has relied on extensive knowledge of the mechanism of the reaction. Here we show that genuinely new enzymatic activities can be created de novo without the need for prior mechanistic information by selection from a naive protein library of very high diversity, with product formation as the sole selection criterion. We used messenger RNA display, in which proteins are covalently linked to their encoding mRNA, to select for functional proteins from an in vitro translated protein library of >10(12 )independent sequences without the constraints imposed by any in vivo step. This technique has been used to evolve new peptides and proteins that can bind a specific ligand, from both random-sequence libraries and libraries based on a known protein fold. We now describe the isolation of novel RNA ligases from a library that is based on a zinc finger scaffold, followed by in vitro directed evolution to further optimize these enzymes. The resulting ligases exhibit multiple turnover with rate enhancements of more than two-million-fold.     

酶改性技术研究

酶具有催化效率高、催化专一性强等显著特点,然而,酶的活力和稳定性往往不能满足应用的要求.为了改进酶的催化特性,笔者及其所在课题组20多年来长期进行酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化、酶定向进化等酶改性技术的研究,发现通过酶的改性,可以显著改进酶活力和稳定性.文中对笔者及其所在课题组在酶改性技术方面的研究成果和进展作了介绍.     

A new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity

Our aim was to improve techniques for drug development by facilitating the identification of small molecules that bind with high affinity to acceptor molecules (for example, cell-surface receptors, enzymes, antibodies) and so to mimic or block their interaction with the natural ligand. Previously such small molecules have been characterized individually on a serial basis. The systematic synthesis and screening of peptide libraries of defined structure represents a new approach. For relatively small libraries, predetermined sequence variations on solid-phase supports have been used, and large libraries have been produced using a bacteriophage vector into which random oligodeoxynucleotide sequences have been introduced, but these techniques have severe limitations. Here we investigate an alternative approach to synthesis and screening of peptide libraries. Our simple methodology greatly enhances the production and rapid evaluation of random libraries of millions of peptides so that acceptor-binding ligands of high affinity can be rapidly identified and sequenced, on the basis of a 'one-bead, one-peptide' approach.     

软件工程中的重用技术

对软件工程在20世纪90年代中常用的开发方法－－软件重用进行了分析,重点讨论了OO技术及类库在新一代软件开发过程中的技术支持,同时也介绍了软件开发中另一个热点－－组件技术。