培养方法及胎牛血清浓度对人胎儿成纤维细胞体外生长的影响

采用单细胞培养法和组织块培养法从原代培养人胎儿成纤维细胞,并在不同体积分数胎牛血清(FBS)(0%、4%、8%、10%、12%)的条件下观察人胎儿成纤维细胞培养的状况并采用台盼蓝染色法进行活细胞计数.结果表明,早期由组织块培养法原代培养获取的细胞形态要比单细胞培养法原代培养获取的细胞稍好些,且在细胞传代后极少出现无法贴壁的死细胞.FBS对hFFs生长影响比较明显.在实际应用中,在体积分数8%FBS下,采用组织块培养法进行人胎儿成纤维细胞体外培养,效果良好.     

玻璃化冷冻保存小鼠受精卵的研究

在20°C室温下,用玻璃化冷冻液(含体积分数为0.3的乙二醇、0.21kg/L的葡聚糖和0.35mol/L的海藻糖)对昆明纯种小白鼠受精卵进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存.一步法的2min平衡组(39%)和二步法的1min平衡组(41%)的胚胎解冻后存活率较好,与对照组(83%)相比有极显著差异(p<0.01).在玻璃化冷冻效果较好组胚胎的子宫移植中,妊娠受体率、妊娠受体产仔率和移植受体产仔率均与对照组无显著差异(p>0.05).     

小鼠胎儿成纤维细胞的冷冻保存研究

为了摸索小鼠胎儿成纤维细胞冷冻保存的简易方法,采用常规冷冻和玻璃化冷冻2种模式,探讨了不同的冷冻方法、不同的冷冻前平衡时间、不同的冷冻保护液的配比等因素对成纤维细胞冷冻效果的影响。实验结果表明:常规冷冻采用含10%(体积分数)甘油的DMEM液作保护剂,可将0~5℃下平衡时间缩短至45~60 min,细胞活力可达0.87。玻璃化冷冻采用10%(体积分数)NBS+1.8 mol/L乙二醇+0.1 mol/L蔗糖的PBS冷冻小鼠胎儿成纤维细胞效果好于其他组合,细胞活力可达到0.86。玻璃化冷冻法与常规冷冻法的冷冻效果差异不显著。     

不同冷冻保护剂对鸡胚胎干细胞冻存与复苏的影响

通过计算复苏后细胞存活率以及观察细胞生长状态.比较了二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)和甘油3种冷冻保护剂对鸡ES细胞的冷冻保存效果.结果 显示:1)当DMSO的浓度为5%、10%和15%时.鸡ES细胞复苏后的存活率分别为73.57%、85.47%和78.90%;当EG浓度为5%,10%和15%时.复苏后细胞存活率分别为68%、74.30%和67.70%:当甘油浓度为5%、10%,和15%时细咆的复苏存活率分别为31.20%、51.40%和50.60%.在相同浓度下.以DMSO保护效果最佳.EG次之.甘油最差,同一种保护剂.以10%浓度的保存效果最好;2)以DMSO为冷冻保护剂.复苏后的鸡ES原代培养在饲养层上可以较好的生长.并形成集落.当浓度为10%时AKP阳性克隆数最高为23.5个,上述结果提示.以10%的DMsO作为鸡ES细胞的冷冻保护剂效果最佳.     

乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠 2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的 评价用乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠 2-细胞胚胎冷冻保存的效果。方法 通过超排卵处理 后与雄鼠交配获得长爪沙鼠 2-细胞胚胎,胚胎在冷冻液 EFS20 中平衡 3 min,然后移入冷冻液 EFS40 中平衡 1 min, 之后将细胞冻存管直接浸入液氮中保存。采用二步法复苏胚胎,复苏后移入改良的胚胎培养液( mKSOM) 中体外 培养。结果 采用该方法冷冻的胚胎复苏后胚胎回收率为 86. 73% ,存活率为 82. 94% ,复苏后存活的胚胎中约 1 / 3 胚胎可以在体外发育到囊胚。结论 乙二醇玻璃化冷冻液适于冷冻保存长爪沙鼠 2-细胞胚胎。     

昆明小鼠未成熟卵母细胞OPS和SSV冷冻保存的比较

目的寻找昆明小鼠卵母细胞冷冻保存效率的新途径。方法选用5~6周龄雌性昆明小鼠的未成熟卵母细胞,在不同前处理液(10%EG或10%EG+10%DMSO)中平衡5 min,然后在冷冻液(EFS30、EFS40、EDFS30或EDFS40)中平衡30 s后进行OPS(Open pulled straw)法和SSV(Solid-surface vitrification)法玻璃化冷冻保存。结果小鼠未成熟卵母细胞的OPS法冷冻保存中,用EFS液冷冻的卵母细胞解冻后形态正常率最高为84.4%,成熟率低于16.7%;而在SSV法冷冻保存中,用EFS液冷冻的卵母细胞解冻后形态正常率最高为86.0%,成熟率为46.5%。OPS法和SSV法冷冻小鼠未成熟卵母细胞形态正常率为91.6%和91.4%,与对照组间差异较显著(P>0.01);成熟率为42.9%和59.1%,与对照组差异极显著(P<0.01)。结论多种抗冻保护剂组合使用效果好于单种抗冻保护剂;EDFS冷冻液冷冻保存效果好于EFS,尤其是EDFS30;OPS法可以有效地冷冻保存小鼠未成熟卵母细胞,且新型玻璃化冷冻法SSV法冷冻保存效果优于OPS法。     

快速诱导细胞凋亡方法探讨

[目的]利用流式细胞仪检测细胞凋亡在基础研究、疾病诊断及预后预测及评价中具有重要的应用价值.补偿调节所需的单阳染色管的制备,是流式细胞术检测凋亡过程的一个重要步骤.探讨了快速诱导不同细胞系和原代细胞凋亡的方法,优化用于检测细胞凋亡的流式单阳染色管快速制备.[方法](1)分别用100μmol/L H_2O_2、体积分数4%多聚甲醛、75%乙醇和反复冻融的方法处理293T细胞15 min、30 min、1 h, Annexin V-PE/7-AAD双标记流式检测293T细胞凋亡率.(2)体积分数1%乙醇、5%乙醇、10%乙醇和20%乙醇处理293T细胞、RAW264.7细胞、HeLa细胞、T细胞和B细胞1 min,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.[结果](1)293T细胞经100μmol/L H_2O_2、体积分数4%多聚甲醛、75%乙醇和反复冻融法处理后,几乎所有细胞均处于凋亡状态.(2)293T细胞、RAW264.7细胞、T细胞和B细胞用1%乙醇处理1 min, HeLa细胞用20%乙醇处理1 min,可出现较明显的凋亡现象.[结论]细胞凋亡实验时,根据细胞的生长特性,可选择体积分数1%～20%的乙醇诱导1 min,作为制备单阳染色管的最佳方案.     

黄腹角雉精液的低温保存

1999— 2 0 0 3年从 17只笼养黄腹角雉 (Tragopancaboti)采集精液 ,稀释后分别保存于 4℃的冰箱和 - 196℃液氮中 .在 4℃条件下 ,保存于生理盐水、C 2液、Lake液、Beltsville液等不同稀释液中的精液 ,其精子存活状况相差很大 ,其中保存于Beltsville液中的精子存活率 (S)最高 ,4 8h后仍有 6 0 %以上的活精子 .在精液的冷冻保存方面 ,受降温过程中精子内外渗透压的变化和结晶的影响 ,且对于冷冻保护剂 (二甲基亚砜 ,DMSO)的体积分数 (φ)以及降温速度的选择非常重要 :DMSO的 φ过高 (如 10 % )或过低 (如 1% ) ,都会大幅降低冷冻后精子的S ,实验发现 φ为 4 %的DMSO最适于黄腹角雉精液的冷冻保存 ;以不同的速度降温 ,也显著地影响着精液的保存效果 (P <0 .0 5 ) .     

一种血清替代物对MDCK细胞培养特性的研究

为评估一种血清替代物(Billion cell)支持动物细胞体外培养的效果,分别在含10%Billion cell(3个储存温区37℃、4℃、-20℃)和10%FBS的DMEM培养液中连续传代培养MDCK细胞,利用传代稳定性观察、克隆形成率、绘制生长曲线及生长动力学分析的方法,评价Billion cell对MDCK细胞促生长效果的影响.结果显示:静置培养,-20℃、4℃储存温区的Billion cell和FBS能较好促进MDCK细胞增殖,平均集落形成率从高到低依次为-20℃Billion cell、FBS、4℃Billion cell、37℃Billion cell;生长动力学分析发现平均比生长速率、平均倍增时间和最大增殖浓度从高到低依次为-20℃Billion cell、FBS、4℃Billion cell、37℃Billion cell,故-20℃储存温区的Billion cell支持MDCK细胞培养效果最佳且优于FBS.通过Billion cell对MDCK细胞培养效果影响的研究,旨在开发替代牛血清支持动物细胞培养的有效血清替代物,为生物制品生产提供必要条件.     

五子衍宗丸细胞干预液的制备及其抗NTDs细胞凋亡的作用研究

采用超高效液相色谱法对五子衍宗丸中金丝桃苷的含量进行了测定,并比较了70℃蒸馏水、常温蒸馏水、体积分数70%乙醇、无水乙醇和DMSO等5种溶剂对金丝桃苷的提取效果;在此基础上,优选出细胞干预液制备方法,观察五子衍宗丸对NTDs细胞凋亡的防控作用。结果显示,金丝桃苷在0.004~0.1μg范围内具有良好的线性关系(r=0.999 9);平均回收率为98.85%,RSD为3.86%;5种提取溶剂中体积分数为70%乙醇对金丝桃苷的提取效果最好;以五子衍宗丸70%乙醇提取物干预NTDs细胞,能够明显提高细胞存活率,有效抑制细胞凋亡。     

松材线虫低温冷冻保存研究

为满足大量松材线虫虫株长期保存的需要,对其低温冷冻保存技术进行了研究。试验比较了不同种类及浓度冷冻保护剂对松材线虫在低温冷冻保存时的保护效果,以及冷冻线虫繁殖力与致病力的变化。结果表明:使用15%甘油和4%DMSO作为冷冻保护剂,经-80℃保存1 d后,松材线虫存活率分别为(39.4±6.6)%和(37.5±21.8)%,且冻存10 d、1个月后均没有显著性下降。与未冷冻的线虫相比,冷冻线虫的繁殖力与致病力均未发生改变。     

青虾精子超低温冷冻保存技术的研究

本文对青虾精子的超低温冷冻保存技术进行了研究.采用台盼兰染色法检测低温冷冻后青虾精子的活力,研究了3种稀释液(壬氏液,Kurokura extender,D-20)和3种冷冻保护剂(8%DMSO,12.5%甘油,10%甲醇)对青虾精子在超低温冷冻保存时的保护效果,以及不同保存时间后青虾精子活力的变化.结果表明,青虾精子以壬氏液为稀释液,添加8%DMSO作为抗冻保护剂,4℃平衡30 min,-20℃平衡15 min,-80℃平衡15 min后投入液氮中保存,解冻时将冷冻管浸入55℃水浴中10~15 s至半融取出自然解冻,精子能维持60%的存活力.本研究为青虾精子冷冻保存库的建立提供了实验依据和理论基础.     

不同冷冻保护剂和冷冻方法冷冻小鼠4-细胞胚胎对其体外发育的影响

采用丙二醇(PROH)、乙烯乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)和甘油(G)4种不同的冷冻保护剂,慢速冷冻、Vit-Master玻璃化冷冻两种冷冻方法冷冻小鼠4-细胞胚胎.发现采用慢速冷冻方法冷冻小鼠4-细胞胚胎时,以丙二醇为冷冻保护剂的胚胎成活率、囊胚形成率、囊胚孵出率显著高于以DMSO、G为冷冻保护剂的结果(P＜0.05),而以DMSO、G、EG为冷冻保护剂的结果间及以PROH、EG为冷冻保护剂的结果间没有显著性差异(P＞0.05).采用Vit-Master玻璃化冷冻方法冷冻小鼠4-细胞胚胎时,以EG为冷冻保护剂的胚胎成活率、囊胚形成率、囊胚孵出率显著高于以PROH、DMSO、G为冷冻保护剂的结果(P＜0.05),而以PROH、DMSO、G为冷冻保护剂的结果间没有显著性差异(P＞0.05).     

小黄鱼精液超低温冷冻保存技术的试验研究

为了研究小黄鱼精液超低温冷冻保存技术,分别比较了3种抗冻剂、3种降温方法和2种复温温度对冷冻精液的影响。结果表明:采用Riger’s液作为稀释液、10%DMSO为抗冻剂,冷冻精液的激活率和受精率最高,与其他两个实验组差异显著(P0.05),分别为92.36%和81.36%;以10℃/min的降温速率将精液降至-80℃后液氮保存,40℃水浴解冻比室温解冻可以获得更好的受精效果,受精率和孵化率分别为78.47%和75.47%。     

8种有机溶剂对肿瘤细胞的细胞毒作用

实验中常需要有机溶剂溶解水溶性较差的待筛选样品,笔者为抗肿瘤药物体外筛选时选择适宜体积分数下低毒且溶解性能好的有机溶剂作参考.用改良MTT法测试8种常用溶剂对2种人肿瘤细胞株生长的影响.甲醇、乙酸乙酯、乙醇、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、氯仿、丙酮和正丁醇对人肺癌细胞株A549的IC50分别为3.50,0.61,2.09×10-2,3.79×10-2,4.07×10-3,2.10×10-2,4.04×10-3,2.62×10-4?μg/mL;甲醇、乙酸乙酯、乙二醇、二甲基亚砜、氯仿、丙酮和正丁醇对人肝癌细胞株BeL-7402的IC50分别为0.28,0.89,5.82×10-2,9.67×10-3,5.54×10-2,8.00×10-3,1.61×10-3?μg/mL.结果说明体积分数为0～10%的甲醇和乙酸乙酯细胞毒性甚微,宜选用;乙醇、乙二醇选用低于3%的体积分数;DMSO宜用低于1%的体积分数;丙酮和氯仿宜选择低于0.3%的体积分数;正丁醇的细胞毒性较强,不适合用于筛药中.     

不同体积分数二甲基亚砜对DNA变性的影响

利用原子力显微镜和动态光散射研究不同体积分数二甲基亚砜(DMSO)对质粒及线性DNA变性的影响。结果表明,体积分数1%的DMSO也能导致DNA发生局部变性,这个结果可以用原子力显微镜直接观测。同时,由于质粒DNA连接数的守恒以及DNA单链的产生,通过原子力显微镜和动态光散射发现,DNA随DMSO体积分数的增加逐渐形成超螺旋结构,DNA聚拢程度增加;DMSO体积分数从0增加到10%时,pBR322 DNA、5 000 bp DNA及λ-DNA的平均粒径分别从(474±10) nm、(554±11) nm和(871±17) nm降低到(257±8) nm、(282±18) nm和(449±21) nm。     

银杏残叶添加比例对猪粪好氧堆肥的影响

采用好氧堆肥方法,研究了不同银杏残叶添加比例(质量分数0%、10%、20%,30%,40%)对猪粪堆肥的影响,结果表明:添加质量分数20%和30%银杏残叶堆肥在第3天分别达到最高温65 ℃和63 ℃,且高温阶段(>55 ℃)持续时间达7 d,完成主要发酵过程约需28 d,明显少于未添加银杏残叶堆肥(对照)所需时间(约37 d)。堆熟后,各处理堆肥有机碳含量(质量分数)在25%～28%之间,无显著差异,均符合有机肥国家标准。各处理堆肥全N(TN)含量(质量分数)在2.26%～3.20%之间。与对照相比,添加质量分数20%银杏残叶处理TN增加最高,达41.5%。各处理堆肥的碳氮比(C/N)和T值(堆肥结束与初始C/N的比)均符合猪粪堆肥腐熟标准(C/N<20、T值<0.6)。添加质量分数20%和30%银杏残叶处理的种子发芽指数在堆制28 d时,已达80%以上,而其他处理则在35 d后才达到。综合来看,添加质量分数20%～30%的银杏残叶有利于猪粪好氧堆肥的熟化、稳定及质量提高。     

Me2SO浓度及预处理条件对组织工程化真皮活性的影响

以二甲基亚砜(Me2SO)为低温保护剂,在就Me2SO浓度、处理温度及时间对真皮成纤维细胞的活性影响进行研究的基础上,研究了Me2SO浓度对低温保存后组织工程化真皮活性的影响.采用胎盼蓝拒染法和四唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率.结果表明,Me2SO浓度、预处理时间及温度对细胞及组织的活性有明显影响.将添加低温保护剂后的细胞悬液在4℃下保持20 min有利于保持较高的细胞活性;且当Me2SO的体积分数在10%~20%时,可使低温保存后的组织工程化真皮组织的细胞活性保持在60%以上.     

镁离子提高融合株SPSC耐酒精性能机制

生长阶段和冲击阶段均添加3．5 mmol／L Mg^2 能显著提高融合株SPSC在20％(体积分数)酒精冲击下的存活率：经过9h冲击,对照组的存活率为0,而添加Mg^2 试验组的存活率为53．1％,表明适当浓度的Mg^2 能显著提高菌体的耐酒精能力,通过考察Mg^2 对菌体在15％(体积分数)酒精冲击下细胞膜透性的影响发现,生长阶段和冲击阶段均添加3．5 mmol／L Mg^2 的试验组的胞外核苷酸平衡浓度和细胞膜透性系数(P′)分别仅为对照组水平的45．6％和15．6％,表明添加适当浓度的Mg^2 能显著降低受冲击茵体的细胞膜透性;而且,添加Mg^2 提高存活率与添加Mg^2 降低胞外核苷酸浓度和P′存在直接的对应关系。因此,Mg^2 提高融合株SPSC耐酒精能力是与其降低受冲击菌体细胞膜透性密切相关的。     

人脐静脉内皮细胞培养液的选择

目的:筛选出人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代、传代最适培养液.方法:0.02%II型胶原酶灌注脐静脉消化15min获得细胞,用不同的培养液培养.24h后观察细胞贴壁状况,细胞计数法得到贴壁细胞数量;内皮细胞标志性蛋白vWF进行细胞鉴定.传代培养后,用MTT法比较不同培养液对HUVECs活力的影响.结果:用含ECGS、20%FBS的ECM组进行原代培养,可获得贴壁细胞数量最多的HUVECs,且与其他组间有显著差异;用含30ng·mL-1 VEGF165、10%FBS的M199进行传代培养,HUVECs活力较ECM组无明显差异.结论:HUVECs原代、传代培养分别选用优化后的培养液,既保证原代HUVECs的质量和数量,又使传代培养成本降低60.8%.