IL18-IL2融合基因的克隆及其在大肠埃氏菌(E.coli)中的表达

构建IL-18和IL-2成熟区的融合基因IL18-IL2,并实现其在大肠埃氏菌中的大量表达.抽提经PHA刺激增殖的人淋巴细胞总RNA,RT-PCR法获得IL-18和IL-2基因的成熟区序列,并通过一段Linker相连得到融合基因IL18-IL2;将IL18-IL2克隆至原核表达载体pBV220,并转化至大肠埃氏菌BL21(DE3);阳性克隆经42℃温度诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达情况及正确性.经SDS-PAGE分析,融合基因IL18-IL2在宿主菌中能够表达,其相对表观分子质量约为34.5 kD;Western blot进一步证明重组蛋白正确.实验结果表明,已成功构建了表达人IL18-IL2的菌株,为进一步研究融合蛋白IL18-IL2体内外抗肿瘤活性提供了基础.     

尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化

将尖吻蝮蛇类凝血酶基因克隆到载体pET32a(+)上,在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达N端融合了硫氧还原蛋白的类凝血酶.通过SDS-PAGE检测融合蛋白条带,纤维蛋白原凝结实验检测酶学活性.确定表达菌株后,对其诱导条件进行优化,在30℃诱导3 h,诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol·L-1条件下类凝血酶表达水平最高.     

重组嵌合生长抑素工程菌的构建、表达与免疫

将动物生长抑素(SS)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合基因插入p ET28a系统,构建重组质粒pET28a-A4030-2-LTB并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,获得了大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)p ET28a-A4030-2-LTB,然后使用SDS-PAGE检测该融合蛋白的表达并优化其发酵与包涵体洗涤条件,接着采用亲和层析法进行纯化,并用Western Blotting技术检测该融合蛋白的免疫原性.研究结果表明,在37℃,加入1 mmol/L的IPTG培养3 h后,融合蛋白的表达量最高且稳定表达;在包涵体洗涤的过程中,使用含有φ=1%的Triton X-100、2 mol/L尿素和0.5 mol/L NaCl的缓冲液洗涤包涵体沉淀,其效果最佳,用Western Blotting方法检测出该蛋白能发生抗原抗体反应,并且将重组蛋白免疫7只小鼠后,其中有6只小鼠产生了抗SS抗体,表达产物具有免疫原性.此研究为进一步开发生长抑素基因工程疫苗提供了可靠的实验依据.     

胰高血糖素样肽-1改善过氧化氢诱导的血管内皮氧化损伤

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对过氧化氢(H2O2)诱导的内皮细胞氧化损伤的保护作用及机制.方法:取人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为正常对照组、H2O2组、GLP-1组、H2O2+浓度10 nmol/L GLP-1组、H2O2+浓度100 nmol/L GLP-1组、H2O2+浓度1 000 nmol/L GLP-1组.采用荧光显微镜检测细胞内活性氧自由基(ROS)水平、观察细胞骨架F-actin变化;采用流式细胞仪检测细胞凋亡比率;Western Blotting检测磷酸化的雷帕霉素靶蛋白(p-m TOR)蛋白水平;实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)检测抗氧化酶:过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)基因的表达变化.结果:H2O2组细胞骨架破坏明显,细胞内ROS含量增加,细胞凋亡率增加;加入GLP-1后,细胞骨架破坏受到显著抑制,ROS含量减少,凋亡率降低.Western Blotting结果显示,H2O2组p-m TOR表达降低,GLP-1可以提高p-m TOR表达,使蛋白水平趋于正常;加入GLP-1受体拮抗剂艾塞纳肽(9~36)后,GLP-1不能上调p-m TOR表达.H2O2作用后,CAT、SOD2和GPX1基因表达降低,而GLP-1可以逆转这些基因表达的降低.结论:GLP-1通过上调抗氧化应激酶对抗H2O2诱导的内皮细胞损伤,且可能是通过活化m TOR通路起保护作用.     

盐胁迫对小麦幼苗叶片H2O2产生和抗氧化酶活性的影响

以耐盐性不同的两个小麦品系89122和9614为材料,研究了NaCl处理对其幼苗叶片H2O2、MDA及SOD、CAT和APX等生理指标的影响.NaCl处理后89122和9614小麦幼苗叶片中H2O2的含量都增加.检测MDA含量显示:150 mmol.L-1NaCl处理12 h和24 h,89122小麦叶片MDA含量变化不明显,处理48 h MDA含量与对照比增加约为30%;同样,NaCl处理使9614幼苗叶片内MDA含量增加.150 mmol.L-1NaCl处理后89122小麦叶片SOD活性增加;而9614小麦叶片SOD的活性与对照比变化不明显.盐处理的早期89122小麦叶片的CAT活性变化不明显,处理48 h后活性比对照增加约20%;而盐处理使9614小麦的CAT活性明显下降.150 mmol.L-1NaCl处理12,24,48 h使89122叶片APX活性分别增加为对照的135%、133%和119%,而9614小麦叶片中APX活性分别降为对照的73%、70%和71%.实验结果表明:NaCl处理使89122和9614小麦叶片中H2O2、MAD含量增加,但89122小麦增加的幅度明显小于9614小麦.此外,盐胁迫使89122小麦叶片的SOD、CAT和APX活性增加;但9614小麦SOD活性变化不明显,而CAT和APX活性明显抑制.     

绿色荧光蛋白α2b-干扰素融合蛋白的表达与活性研究

采用基因重组技术,构建原核表达质粒pET 32a( )/GFP-α2b-IFN,转化大肠杆菌BL 21,以IPTG诱导融合蛋白的表达并用镍金属螯合层析柱进行纯化.SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,46.0 kD的融合蛋白在大肠杆菌中得到了正确的表达,并具有α2b-IFN的抗原活性.受体结合实验表明,该融合蛋白能够与W ISH细胞上的干扰素受体特异性结合,并在激发光下呈亮绿色荧光.采用细胞病变法测定分离纯化的融合蛋白的抗病毒活性,比活力为1.0×107IU/m g.表达的GFP-α2b-IFN融合蛋白具有α2b-IFN的特性与荧光活性,为研究α2b-IFN受体功能以及IFN与细胞相互作用的机理奠定了基础.     

家蚕抗菌肽CM4和人可溶性BAFF融合基因的克隆、表达及活性鉴定

采用PCR法从含有人可溶性BAFF基因的pET30a( )扩增得到人sBAFF基因,通过rPCR将抗菌肽Cecropin CM4基因的2条单核苷酸链进行扩增得到CM4基因,再采用over-lap PCR法通过linker将hsBAFF与Cecropin CM4融合基因相连接.经纯化和鉴定后,定向插入到原核表达载体pET30a( )中,然后转化E.coliBL21(DE3),通过实验确定了表达该融合基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为5 h.温度为30℃,其表达量占全菌蛋白的40%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到相对分子质量约为22 000的重组蛋白并且存在超声裂解后的上清中.重组蛋白经Western blot检测,结果显示重组蛋白可被鼠抗人可溶性BAFF的抗体识别.采用分子筛Sephadex G-75对重组融合蛋白进行纯化,并经SDS-PAGE对其鉴定.通过对其生物学功能的检测得知,纯化后的重组融合蛋白对大肠杆菌K12D31和真菌有明显的抑菌能力.     

奇球菌pprI基因增强枯草芽孢杆菌细胞抗性的研究

pprI是近来在奇球菌(Deinococcus Radiodurans)中发现的一个极其重要的DNA修复开关基因.本实验利用穿梭质粒pRADZ3将其转入枯草芽孢杆菌(B-1)中稳定表达,并与转化了空白质粒的菌株(B-2)对照,观察了改造后的两种菌株在H2O2氧化压力和紫外线辐照下的存活率.结果表明,在两种情况下B-1菌株存活率明显高于B-2菌株.证明奇球菌pprI基因在枯草芽孢杆菌中的稳定表达能够增强细胞抗氧化与抗紫外辐射能力.     

hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒的构建与表达

为构建hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒,筛选其高效表达工程菌,设计特异性引物,PCR扩增目的基因并克隆至pPROEX HTb质粒Nco Ⅰ/HindⅢ位点,经双酶切及序列测定筛选阳性克隆,IPTG诱导工程菌后以SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达情况,并测定其抗原性和生物学活性,结果成功构建了工程菌Top1O F'[hIL-2/IFN-γ],经优化表达条件后,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的30%,分子质量约为34 ku.ELISA和Western-blot实验结果表明,目的蛋白能特异性结合抗IFN-γ抗体,呈阳性反应,生物学活性测定显示其IL-2和IFN-γ比活性分别为1.7×107U/mg与3.2×106U/mg.     

水稻OsDHHC13基因参与氧化胁迫响应的初步研究

DHHC型锌指蛋白参与细胞内蛋白质的棕榈酰化修饰,对细胞和个体的生长发育起着重要的调控作用.OsDHHC13是典型的DHHC型锌指蛋白基因.生物信息学分析发现,OsDHHC13的启动子区域含有胁迫及光响应元件,而且其编码蛋白是具有4个跨膜结构域的典型膜蛋白.对OsDHHC13过表达株系进行H2O2的氧化胁迫处理发现,过表达株系幼苗的根显著长于野生型,说明OsDHHC13能解除H2O2对根生长的抑制,提高了抗氧化胁迫的能力.随后H2O2含量测定发现,OsDHHC13过表达株系幼苗根部的H2O2含量显著低于野生型.进一步的qRT-PCR分析发现,与清除H2O2相关的酶基因的转录水平在过表达株系中显著升高,说明OsDHHC13能促进清除H2O2的相关酶基因的表达,调节内源性H2O2的动态平衡.总之,本研究结果初步证明锌指蛋白基因OsDHHC13正调控水稻的抗氧化胁迫能力.     

双酚A对河蚬呼吸代谢和抗氧化酶的毒性研究

采用静态染毒法,研究了双酚A(bisphenol A,BPA)对河蚬(Corbicula fluminea)的急性毒性和BPA在1/2 LC50, 1/4 LC50, 1/8 LC50, 1/10 LC50亚急性浓度胁迫下耗氧率和排氨率以及抗氧化酶系统中 SOD、CAT活性的变化,以探究河蚬在BPA胁迫下的生物学响应.结果显示:BPA对河蚬96 h-LC50为6.34 mg·L-1;亚急性毒性指标耗氧率、排氨率以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）对BPA比较敏感,在本试验浓度范围内（0.63 ～3.17 mg·L-1）河蚬耗氧率、排氨率以及两种酶活性变化均呈现先下降后上升再下降的趋势,且有较好的一致性和规律性.结果表明,BPA对河蚬产生了氧化损伤,具有一定的毒性作用.     

外源一氧化氮对铬胁迫下小麦幼苗生理的影响

研究了在40 mg·L^-1Cr6＋胁迫下,0.1 mmol·L^-1～1.0 mmol·L^-1外源NO供体硝普钠（SNP）处理对小麦幼苗生长、叶绿素含量、丙二醛含量、相对电导率、叶片保护酶（SOD、POD和CAT）活性和可溶性糖含量的影响.结果表明,NO缓解小麦幼苗Cr6＋胁迫具有剂量效应,以0.4 mmol·L^-1SNP的效果最好.     

氢氧化铜/过氧化聚吡咯修饰电极的制备及其对葡萄糖的催化氧化

采用循环伏安法制备了氢氧化铜/过氧化聚吡咯膜修饰电极(Cu(OH)2/PPyox/CCE),并对其进行了表征。研究了该修饰电极对Glu的电催化氧化活性。结果表明,该修饰电极对Glu的氧化具有良好的电催化活性。在优化条件下,安培法检测Glu的线性范围为2.0×10-7～1.2×10-3mol.L-1,灵敏度最高为2500.0μA.mmol-1.cm-2,检出限(3Sb)为1.0×10-7mol.L-1,加标回收率为96.5%～100.6%。该方法已用于血清中葡萄糖含量的测定。     

血红蛋白在银微粒修饰镍铬电极上的直接电化学行为研究

以镍铬合金为基体电极,采用电沉积技术制备了银微粒电极.用扫描电镜表征了基体电极电沉积前后的形貌特征.利用循环伏安技术研究了该银微粒电极对血红蛋白(Hb)的直接电化学行为.实验结果表明具有立体结构的银微粒对血红蛋白具有良好的电催化活性,实现了血红蛋白分子的直接电子转移.在1×10-6 mol·L-1~2×10-5 mol·L-1范围内,Hb氧化峰电流和Hb浓度有较好的线性关系.该银微粒电极制备简单,性能稳定,使用寿命相对较长,可有望用于蛋白质的分析测定和实现Hb在第三代生物传感器的开发和应用.     

植酸钛纳米材料固定酶制备过氧化氢传感器

利用植酸盐分子中磷酸基团与部分金属离子的强络合能力,通过微波合成法合成植酸钛纳米材料,并运用这种材料结合混合滴涂的方法将辣根过氧化物酶成功修饰到玻碳电极表面.运用紫外-可见光谱和电化学,实验结果证明了这种材料具有良好的生物相容性,有利于防止酶在固定化过程中生物活性的损害.此法制备的生物传感器实现了辣根过氧化物酶(HRP)和玻碳电极之间的直接电子转移,且对过氧化氢呈现出良好的催化还原作用,对H2O2检测的响应电流线性范围是6.67×10-7~4.73×10-5mol·L-1,线性相关系数R=0.9988(n=20),检测限为4.0×10-7mol·L-1(S/N=3),米氏常数(Kapp M)为0.036 mmol·L-1.所制得的生物传感器呈现出良好的重现性和稳定性.     

二氧化锡修饰碳糊电极检测过氧化氢的研究

利用二氧化锡修饰碳糊电极开展过氧化氢的检测.采用循环伏安法和电流-时间曲线法对H2O2进行测定.研究磷酸缓冲溶液的pH、二氧化锡修饰含量等因素对该修饰电极测定H2O2的影响.在优化实验条件(pH=5.7,SnO2与石墨的质量比为1∶5)下,H2O2检测线性范围在1.0×10-5～2.19×10-3 mol.L-1内,还原峰电流与H2O2浓度呈良好线性关系.检测限为2.5×10-6mol.L-1(S/N=3).该传感器具有制备简易、成本低廉、响应快、灵敏度高、稳定性好等特点,具有较好的应用前景.     

氨氮胁迫对黄河鲤幼鱼肝胰脏、肾脏抗氧化性的影响

为了探讨养殖水体中氨的毒性,在前期毒性实验的基础上设置氨氮质量浓度分别为0.071 mg·L-1、0.143mg·L-1、0.284 mg·L-1和0.427 mg·L-1的四个实验组和一个对照组对黄河鲤鱼(Cyprinus carpio)幼鱼进行毒性实验,实验期间pH值在7.80～7.85。分别在实验的0 d、7 d、14 d、28 d、35 d取样,检测肝胰脏、肾脏组织中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量。结果表明,随氨氮暴露浓度的增加,黄河鲤鱼肝胰脏中的SOD和GSH-Px酶活性呈现先升后降的趋势,而MDA含量则呈现上升的趋势。方差分析表明,氨氮暴露浓度对于肝胰脏SOD活性、MDA含量影响效果极显著(P<0.01),且存在剂量-效应关系;随氨氮暴露浓度的增加,肾脏中SOD活性、GSH-Px酶活性均呈现先升后降趋势且效果显著(P<0.05),而肾脏中MDA含量呈现上升趋势且效果极显著(P<0.01),另外肾脏MDA活性与氨氮浓度之间存在显著的剂量-效应关系;氨氮暴露时间对于肝胰脏SOD活性、肾脏SOD、GSH-Px活性的影响表现为低浓度时先促进后抑制,高浓度时抑制,方差分析差异不显著(P>0.05)。可见,在实验浓度范围内氨氮降低鲤幼鱼的抗氧化能力,SOD、MDA可作为有效的生物标志物对氨氮引起的毒性做出评价。     

MAP kinase specifically mediates the ABA-induced H<Subscript>2</Subscript>O<Subscript>2</Subscript> generation in guard cells of<Emphasis Type="Italic">Vicia faba</Emphasis> L.

The plant hormone abscisic acid (ABA) is involved in regulating adverse physiological processes, including stomatal closure, seed development and germination, and mediating many environmental stress responses, such as drought, salinity and extreme temperatures[1,2]. In re-sponse to various stress stimuli, ABA synthesis is in-creased in plant cells, which triggers a series of physio-logical responses to adapt the stress conditions[1—3]. For example, under water deficit, ABA acts directly on…     

N-月桂酰基甘氨酸钠的制备与性能表征

通过月桂酰氯和甘氨酸合成了N-月桂酰基甘氨酸钠,用元素分析、红外光谱、核磁共振进行了结构表征.结果表明合成产物为目标化合物.并对其表面化学性能和应用性能进行了测试:N-月桂酰基甘氨酸钠溶液在0.50mol·L-1 NaCl浓度下,其临界胶束浓度(Ccmc)为1.118mol·L-1,临界胶束浓度下的表面张力(γcmc)为31.1mN·m-1,具有较高的表面活性.应用性能亦较佳.     

铜胁迫对甜菜幼苗生长和光合特性的影响

以甜菜品种KWS3418为实验材料,研究了铜胁迫对甜菜幼苗生长及光合作用特性的影响．结果表明：当Cu2＋≤250μmol·L-1时,甜菜幼苗生长良好,与对照（0．3μmol·L-1）相比,各生长指标没有显著差异．但是,随着Cu2＋浓度的增加（Cu2＋〉250μmol·L-1）,甜菜幼苗生长受到显著抑制,其单株干、鲜重和叶面积均显著下降．Cu2＋为250μmol·L-1时,净光合速率（pn）、气孔导度（Gs）与叶绿索含量显著低于对照组,随着Cu2＋浓度的增加,净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）与叶绿素含量急剧下降．这些结果表明,甜菜有一定的耐铜性,但是高铜处理可能通过引起叶绿素含量和气孔导度下降来抑制光合作用进而抑制生长．