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相似文献
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1.
TaqMan MGB实时荧光PCR对转基因大豆定量检测的研究   总被引:3,自引:0,他引:3  
 利用实时荧光定量PCR技术,根据转基因大豆(Roundup ReadyTM)的外源基因35S启动子序列设计引物和TaqMan MGB探针,对大豆粉中Roundup ReadyTM大豆含量进行了定量检测,根据这个检测体系建立了35S启动子Ct值与样品中转基因成分数量之间的标准曲线和线性回归方程(相关系数r2: 0.9942)。本研究设计的方法还可以应用到多组分的食品、饲料等加工产品,检测转基因成分的含量,并可作为转基因食品常规PCR定性检测方法。  相似文献   

2.
植物性转基因食品的检测与验证方法   总被引:3,自引:0,他引:3  
根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列,设计并合成了两对不同的引物,建立了PCR-酶切分析-Southern杂交检测并确认转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法.并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测,发现13份样品中有6份检出35S启动子和NOS终止子,7份样品结果为阴性.结果表明建立的检测与验证方法能有效检出转基因作物及其食品中的35S启动子和NOS终止子,具有灵敏度高、特异性好和结果准确的特点,可应用于进出境产品的转基因成分检测.  相似文献   

3.
根据转基因油菜中所转入的外源基因,选择CaMV35S启动子、FMV35S,PAT基因和目的基因mCP4-EP-SPS,BAR,MS8,RF3以及内源PEP基因设计特异性引物,采用多重PCR法对待测样品进行扩增,通过缺口平移法合成DIG-dUTP标记杂交探针,并制备基因芯片,在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时,比较了芯片检测的特异性和重复性,并对检测的灵敏度进行测试,结果表明,该方法具有较好的特异性和重复性,检测灵敏度可达0.1%,由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因,提高了检测的准确性和效率.  相似文献   

4.
转基因花卉的DNA提取与多重PCR分析   总被引:24,自引:0,他引:24  
分别以CTAB法、DNA提取试剂盒提取菊花、矮牵牛、非洲菊3种花卉的基因组DNA,凝胶电泳结果表明试剂盒提取的效果较好。设计合成了3对引物,分别扩增花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(nos)终止子、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(nptⅡ)基因。普通PCR检测结果表明,3种花卉6个样品中仅矮牵牛的1个样品含有这3种转基因成分,酶切鉴定结果验证了PCR产物为非假阳性。尝试以多重PCR同时检测转基因矮牵牛与对照阳性质粒中的2个或3个转基因成分,得到预期结果。  相似文献   

5.
目的 建立用于检测实验动物小鼠中唐菖蒲伯克霍尔德菌的荧光定量PCR方法。方法 参考团标公布的序列合成唐菖蒲伯克霍尔德氏菌引物、探针和质粒,建立荧光PCR方法,并对方法的线性、灵敏度、重复性和特异性等性能进行验证。同时应用建立的荧光PCR方法和细菌培养法对110份小鼠送检样品进行比对检测。结果 建立的唐菖蒲伯克霍尔德菌荧光PCR方法,相关系数R2可达0.998,线性良好;方法最低可检测至1×102 copies/5μL,灵敏度高;方法检测培养的唐菖蒲伯克霍尔德菌为阳性,检测金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌、绿脓杆菌和嗜肺巴斯德杆菌均为阴性,特异性良好。采集110只安乐死小鼠样品,分别进行细菌培养和荧光PCR检测,结果均为阴性,2种方法结果完全符合。结论 建立的荧光PCR方法性能良好,可用于实验动物小鼠唐菖蒲伯克霍尔德菌的检测。  相似文献   

6.
非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立   总被引:1,自引:0,他引:1  
为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析.借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg^2-、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4.5mmol/L,400nmol/L和500nmol/L.同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为10^2个拷贝数的质粒,特异性为100%,CT(Cycle Threshold)值的变异系数CV小于5%.对送检的15份(是否感染ASFV不确定)猪肉样品进行检测,结果全为阴性.试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法.  相似文献   

7.
目的:建立荧光探针PCR检测方法并拟定质量标准,旨在实现快速、准确地检出九味羌活丸(水丸)和香砂养胃丸(水丸)中的掺伪米粉。方法:通过优化样品提取方法,有效提取九味羌活丸和香砂养胃丸复方的基因组;通过文献检索和生物信息学分析,筛选得到适用于本试验的米粉特异性引物和TaqMan探针,并优化PCR检测方法。实验对方法的特异性、检出限、精密度和重复性进行考察,对市售样品进行筛查,并拟定了中成药荧光探针PCR检测方法的检测标准。结果:本实验优化了样品的前处理方法,通过文献检索和生物信息学分析检索到3组特异性引物和探针,并筛选得到了适合本研究的引物和探针。荧光探针PCR方法的检出限为每克样品可检出0.001 g米粉。九味羌活丸精密度的Ct值为30.34,相对标准偏差(RSD)为1.23%;重复性的Ct值为29.88,RSD为1.98%。香砂养胃丸精密度的Ct值为35.43,RSD为2.63%;重复性的Ct值为35.09,RSD为2.11%。对市售的7个厂家13批次样品进行分析,检出来自A厂家的5批次九味羌活丸...  相似文献   

8.
大豆样品中DNA的提取与外源基因CaMV35S的PCR检测   总被引:1,自引:0,他引:1  
采用试剂盒从大豆样品中成功提取出DNA,对花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了电泳检测,建立了提取大豆DNA与CaMV35S启动子PCR检测的方法,对实验操作中的问题进行了探讨.  相似文献   

9.
建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)的方法.根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌基因序列,设计引物和Taqman探针,采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果表明:特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌.以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验,菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系,线性系数(R2)为0.999,扩增效率为88.2%,最低检测浓度为5cfu/mL.对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定,两者结果一致.该方法特异性好、灵敏度高,是快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的有效方法.  相似文献   

10.
根据GenBank中编码猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白ORF2的保守序列, 设计并合成了一对引物和相应的TaqMan探针, 建立了快速检测FCV的荧光定量PCR
方法. 通过对该方法的反应体系和反应条件进行优化, 建立了标准曲线, 给出了特异性、 敏感性和重复性实验, 并对临床24份疑似样品(其中阳性3份、 阴性21份)进行检测.  结果表明: 该方法检测cDNA的线性关系为0.992, 线性范围为2.26×1011~2.26×101拷贝/μL; 可检测出样品中的FCV, 其他猫相关病毒检测为阴性; 批内重复性实验变异系数为2.158%, 与病毒分离结果相符.  相似文献   

11.
多杀巴斯德氏菌是养殖动物(鸡,猪,牛等)的重要致病菌.本研究以16S-23S rDNA间区序列为目的基因设计PCR引物鉴定多杀巴斯德氏菌.通过对多杀巴斯德氏菌ITS-IA(含有tDNA-Ile和tDNA-Ala的16S-23S rDNA间区序列)的测序和与GenBank中序列的BLAST,设计筛选了一对特异引物PS-F/PS-R.对引物的特异性和有效性,用PCR方法进行了验证.结果表明:所有的多杀巴斯德氏菌标准菌株和分离菌株都能被检出,而全部39株非多杀巴斯德氏菌都没有扩增出特异性条带.其检测灵敏度能达到102CFU/mL.研究结果表明,发展了的PCR鉴定方法是省时的和可靠的,整个过程只需要20 h,而传统的鉴定方法需要至少5 d的时间.  相似文献   

12.
通过自行设计引物, 扩增且测定了泥鳅和黄鳝18S rRNA基因部分序列, 并讨论了后生动物18S rRNA基因的碱基含量变化情况. 结果表明, 泥鳅和黄鳝的18S rRNA基因部分序列长度均为1 204 bp, 泥鳅该基因序列GC含量为53.74%, 黄鳝该基因序列GC skew为0.082, 两条序列同源性为99.67%. 将它们和大西洋鲑3个物种的18S rRNA基因与其线粒体12S rRNA,16S rRNA,Cyt b和D loop区4基因进行序列比较, 发现核18S rRNA最保守, 而线粒体D loop区基因进化速率最快. 从GenBank中选择已测定的4种鱼纲动物和11种脊索动物的同源序列, 分别运用NJ法、 MP和ML法, 构建6种鱼纲动物和13种脊索动物的分
子系统树, 结果均显示, 在鱼纲动物系统树中, 6种鱼纲动物被分为软骨鱼类和硬骨鱼类两大支; 在脊索动物的系统树中, 鱼纲与脊椎动物的四足类形成姐妹群, 表明它们在系统发育过程中具有同等重要地位.  相似文献   

13.
在很多国家,转基因生物(GMOs)及其衍生产品必须标有精确的转基因含量.最近研究中,实时定量PCR技术广泛应用于转基因成分的检测.然而,转基因生物的实时定量PCR方法的精确度仍然是一个难以解决的问题,尤其是对于高温处理过的样品.为了更好地准确定量高温处理样品中转基因的含量,对普通的实时定量PCR体系做了一些改进,包括重新设计内源基因和外源基因的引物,使得扩增较短并且大小接近的目标DNA片段,同时引物的GC含量和溶解温度也都相近.此外,采用热处理加工模型(HTPM)的方法,制备了含有转基因大豆GTS 40-3-2的样品,并验证了改进后的实时定量PCR系统.实验结果表明:使用改进后的实时定量PCR体系测定热处理过的样品,发现其中的转基因含量的定量偏差明显降低.同时使用改进的双重实时定量PCR进一步验证转基因大豆的加工食品,结果也显示,转基因含量的定量结果更准确.这些结果表明:改进的双重实时定量PCR将适用于热加工产品的定量检测.  相似文献   

14.
Cre-lox重组系统介导转基因烟草中外源基因删除的研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
对Cre在转基因个体中介导的重组效率进行了研究。构建了含有Cre基因(p35 S-Cre)和GUS基因侧翼含同向loxP位点的(loxP-p35S-GUS-loxP)两种植物表达载体。以共转化的技术将两种基因元件同时转化烟草得到转基因植株,根据对共转化植株GUS基因的活性分析、分子检测、PCR检测及对重组后扩增DNA片段进行序列分析表明:Cre-loxP重组系统在转基因烟草中能精确高效地介导转基因的删除,但也存在部分植株不能完全删除的现象。  相似文献   

15.
为检测绵羊肺炎支原体感染,根据公开发表的绵羊肺炎支原体16SrRNA序列设计特异性引物。建立了PCR诊断方法。通过对绵羊肺炎支原体标准株、临床分离株、丝状支原体山羊亚种及临床病羊鼻拭子的检测。发现应用该检测方法能够对标准株、分离株和临床病羊鼻拭子扩增出特异性产物,而对丝状支原体山羊亚种则扩增小出。证实所建方法在绵羊支原体性肺炎的诊断上具有特异性、相对快速、简便等优点,值得在临床中推广应用。  相似文献   

16.
目的 探讨聚合酶链反应技术(PCR)在检测行蜡包埋组织中金黄色葡萄球菌DNA的应用及价值。方法 利用PCR技术,对55例福尔马林固定、石蜡包埋小鼠组织中SA-DNA进行了检测。结果 55例石蜡包埋的小鼠组织中均检测到SA-DNA,这与临床病理诊断为金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染相一致。结论 PCR技术可用于检测石蜡包埋组织中的SA-DNA片段,为鼠S.aureus感染的回顾性分析提供了有效手段。  相似文献   

17.
应用地高辛标记的PCR-ELISA技术快速检测转基因水稻   总被引:10,自引:0,他引:10  
应用地高辛标记的PcR—ELISA(Dig-PcR—ELISA)技术进行转基因水稻检测研究。针对转基因水稻中普遍存在的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(p35S)、胭脂碱合成酶(NOS)终止子(Thos),筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因(hpt,hph)、β—葡萄糖苷酸酶基因(gus)、抗草丁膦除草剂基因(bar),建立Dig—PcR—ELISA检测方法;能进行半定量检测,敏感性试验表明,Dig—ELISA检测比常规电泳检测可提高敏感性达1000倍,可检测含量达0.1%的GM0样品。全过程可在24h内完成。  相似文献   

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