深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

mRNA差异显示技术研究低温条件下深黄被孢霉基因的表达差异

mRNA差异显示技术已经广泛应用于研究植物、动物和微生物在各种环境条件下基因的差异表达研究.研究以15℃和30℃培养的深黄被孢霉M6-22菌体为材料,利用mRNA差异显示技术研究两种培养条件下基因的表达差异.经实时荧光定量PCR验证,共获得7条差异片段,相似性搜索结果表明它们是6-磷酸葡萄糖异构酶、单糖核苷酸转运蛋白、Ras1鸟苷酸转移因子、依赖于NAD的苹果酸脱氢酶、Δ12-脂肪酸脱氢酶、CLK4关联的丝氨酸/精氨酸丰富蛋白和假定蛋白,涉及糖酵解、蛋白质修饰、信号传导、脂肪酸合成和mRNA加工等生命过程,表明深黄被孢霉M6-22低温适应性是多种途径协同调控的结果.     

γ-亚麻酸产生菌的低能离子束诱变选育

为了得到γ-亚麻酸(GLA)高产菌株,以深黄被孢霉As3.3410为出发菌株,利用氮离子(N+)注入诱变,并采用马来酰肼抗性筛选和红四氮唑(TTC)法相结合对突变株进行筛选。试验结果表明:当能量为10 ke V时,最佳氮离子诱变剂量为1.56×1015cm-2;当马来酰肼的添加量为40 mg/L时,出发菌株的抑制率为100%;TTC法酶活测定的最佳条件为:温度35℃、p H为8.4、TTC浓度为8 g/L、反应时间为1 h,以此作为摇瓶初筛的条件。经过反复诱变筛选获得一株遗传稳定的高产突变株F312,其γ-亚麻酸产量为1 236 mg/L,比出发菌株(480 mg/L)提高了157.5%。     

产油脂微生物菌种的筛选、鉴定及其油脂组成分析

从富含油脂的土样中分离获得47株产油脂菌株,筛选获得7株油脂含量高的菌株,其中菌株华2-1的油脂含量达到48.60%,菌株鉴定表明该菌株为深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina),其油脂的脂肪酸组成与植物油相似,主要为亚油酸、棕榈酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸,含量分别:39.25%,19.67%,2.67%,18.81%和6.67%,不饱和脂肪酸含量达87.07%,为微生物油脂生产奠定基础.     

深黄被孢霉染色体数目及基因组大小的研究

利用钳位均匀电场凝胶电泳（contour-clamped homogeneous electric rield,CHEF)技术分离了γ-亚麻酸（γ-linloenic acid,GLA)生产菌深黄被孢霉AS3.3410(Mortieralla isabellina AS3.3410)的梁色体DNA,电泳核型显示出其具有15条明显的带型,分离的染色体DNA带范围大约为390-2660kb,基因组大小约为21640kb。     

深黄被孢霉的化学诱变

以深黄被孢霉为出发菌 ,通过硫酸二乙酯 (DES)诱变 ,获得优化的变异菌株 XM-1 .经初筛、复筛及传代实验 ,表明其是稳定的变异株 .变异株 XM-1在 2 8℃下 ,发酵 1 2 0 h后 ,菌体生物量为 1 5 .1 g/L ,油脂量为 7.5 g/L .与原始菌相比 ,生物量、油脂量分别提高了43.8%和 47% .     

花生四烯酸产生菌的原生质体诱变育种

采用化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)对由高山被孢霉出发菌株M3-18制备的原生质体进行诱变育种.实验结果表明,采用体积分数为10%的DES诱变3min,可获得高产突变株M20,其花生四烯酸产量比对照株M3-18提高了4.4倍,而且突变株的继代遗传稳定.说明采用原生质体诱变育种是获得花生四烯酸高产菌株的有效方法.     

酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶对α-亚麻酸催化活性的研究

多不饱和脂肪酸(po lyunsaturated fatty ac ids,PU FA s)可分为n-6和n-3两个系列,而Δ6-脂肪酸脱氢酶是这些PU FA s合成途径中的限速酶.将少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INV S-cl,在添加外源性底物α-亚麻酸,经半乳糖诱导后,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-M S)联用分析细胞脂肪酸表明,少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,所生成十八碳四烯酸的含量占酵母细胞总脂肪酸的7.67%,而在空载体pYES2.0转化的酵母中没有检测到.同时,参照K ozak序列,我们把少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列进行适当的改变,并转化INV Scl进行分析,结果显示修改后的序列同样能催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,而且表达量提高到细胞总脂肪酸的11.23%,表明在酿酒酵母中,改变转移起始密码子周边序列可提高少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因催化α-亚麻酸转合成十八碳四烯酸的水平.     

真菌油脂菌种选育与发酵试验研究

以三株被孢霉作为出发菌株 ,进行紫外线诱变 ,以乙酰水杨酸和SDS作为抑制剂 ,筛选具有抗性的突变株 .通过低温和高糖的筛选 ,再进行摇瓶试验 ,得出最适发酵条件 .通过摇瓶发酵测定各菌株的菌体干重、油脂产量 ,碘价和产不饱和脂肪酸的量 ,最终选出三个优良菌株 :A1- 16产GLA 1.5 3g/L ,ARA 1.16g/L ,DHA 0 .0 9g/L ;A2 - 6产GLA 1.11g/L ;S3- 1产GLA 1.80g/L .     

高山被孢霉原生质体转化及延长酶基因同源表达的研究

为了有效提高高山被孢霉(Mortierella alpina)产花生四烯酸的能力,采用聚乙二醇介导的原生质体转化法将重组pD4质粒(含高山被孢霉合成花生四烯酸的延长酶基因GLELO)转入高山被孢霉中,对其转化条件和同源表达进行了研究.结果表明,原生质体最佳转化条件为:以山梨醇作为稳定剂,50mmol/L的Ca2+和聚乙二醇4000作为转化介质,于25℃转化15min后温育,原生质体转化率最高为1.8μg-1.该转化子的摇瓶实验结果显示重组菌中花生四烯酸的产量比原始菌株的产量最高提高了近30%.该研究结果为高山被孢霉的性状改进及其他真菌的的遗传转化提供参考.     

浅析航海过失和管货过失

《海牙规则》确立了海运承运人对航海过失造成的货损免责，航海过失可分为驾船过失和管船过失。但承运人对管货过失造成的货损应承担赔偿责任。区分航海过失，尤其是管船过失与管货过失，成为一项极其重要的任务。近百的来，有关于此的争议不同涌现，国际上要求废除航海过失免责的呼声日益高涨，《汉堡规则》虽废除了航海过失免责，但亦未被国际社会所接受。文章探讨了航海过失与管货过失的区分标准，并尝试建立一种新的承运人责任制度。     

以党内和谐促党群和谐,以党群和谐带社会和谐

党内关系的和谐状态不仅是衡量党的自身建设成效的重要标准,更是提高党的执政能力建设和永葆党的先进性的内在要求。党内和谐是党群和谐的根本,对党群关系和谐与社会和谐起着重要的示范和带动作用。要以党内和谐促进社会和谐,以优良的党风促政风带民风,必须通过党群关系的良性互动来实现。     

以党内和谐促党群和谐,以党群和谐带社会和谐

党内关系的和谐状态不仅是衡量党的自身建设成效的重要标准,更是提高党的执政能力建设和永葆党的先进性的内在要求.党内和谐是党群和谐的根本,对党群关系和谐与社会和谐起着重要的示范和带动作用.要以党内和谐促进社会和谐,以优良的党风促政风带民风,必须通过党群关系的良性互动来实现.     

从银政及银企关系看国家注资改造国有银行的有效性

通过对政府从国有银行退出的艰巨性和国有银行和国有企业之间建立真正债关系的艰巨性的角度,对国家通过注资的方式改造国有商业银行的有效性进行了深入的分析,结果表明:我国国有商业银行的改革决不是简单通过注资就可以一蹴而就的。根据分析的结果提出了对国有商业银行改革的意见和建议。     

智能化电能表及自动抄表系统在住宅中的应用

本文主要论述了智能化电能表及自动抄表系统的组成、特点，以及目前市场上使用的几种主要智能化电能表和自动抄表系统的方式及其发展趋势．     

浅析增加农民收入的基本途径——对三农问题的几点思考

农民收入问题影响到农民的生活水平，影响到农业生产能力，是“三农”的根本问题。从农民、农村、农业三个角度提出了增加农民收入的对策建议。     

浅谈语言在馆员与读者沟通中的运用

阐述了正确运用符号语言与体态语言对改善馆员服务态度、提高馆员服务质量的重要作用。     

建设以公众为中心的电子政府

从我国电子政府的发展现状出发,以上海市各级政府的电子政务为例,对我国各级电子政府建设在迅速发展的同时所呈现出的一些问题及面临的障碍进行分析,并提出以满足公众需求为基点,建设以公众为中心的电子政府,最后提出相应对策与建议,以利真正提高政府的绩效,让公众从中获得真正的收益.     

浅析新闻语言的弊病及其原因

新闻语言是通过新闻媒介,向人们报道新近发生的事实、传播新闻信息的载体之一。它作为媒体传递信息的工具,是一种对社会影响颇大的公共语言行为。时下新闻语言却出现了一系列的问题,已经严重的影响到新闻媒体的自身发展和社会用语的纯净。为了使新闻语言沿着科学、健康的方向发展,本文主要具体阐述了新闻语言弊病的表现形式和原因,希望能给新闻语言的规范提供帮助。     

由对诗人的重估到对新诗史的重构--从《诗刊》看五四以来的新诗传统在五、六十年代的命运

作为二十世纪五六十年代国内最权威的诗歌刊物《,诗刊》无疑代表了当时的文学潮流,并引领着文学的走向。研究自1957年1月到1965年停刊的《诗刊》,可以清晰地把握当时的诗坛动态和文学环境,不失为五六十年代中国文学的一份生动史料。本文着重考察的是《诗刊》如何以对“五四”以来新诗人的重估和对新诗史的重构,完成了新诗在五六十年代的历史叙述。