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相似文献
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1.
比较纳米材料和阳离子多聚物转染试剂携带增强绿色荧光蛋白基因对C2C12细胞和DF-1细胞的转染效率,筛选适合的基因载体。采用Entranster TM-D纳米材料和3种阳离子多聚物(Superfect、Fect、Neofect)转染试剂介导p CDH-EGFP-puro质粒分别转染C2C12细胞和DF-1细胞,24 h后用实时荧光定量核酸扩增检测系统检测转染细胞中增强绿色荧光蛋白基因的mRNA表达水平,48 h后观察并计数阳性细胞率。结果发现4种试剂分别转染的两种细胞中均有增强绿色荧光蛋白基因的表达。C2C12细胞用阳离子多聚物转染的效率略高于纳米材料转染,其中Superfect的转染效率可达到30%;DF-1细胞用纳米材料和阳离子多聚物转染的效率都高,其中Fect的转染效率达到50%。因此,阳离子多聚物Superfect用于C2C12细胞的体外转染,Fect转染试剂用于DF-1细胞的体外转染,都表现出较高效的转染效率  相似文献   

2.
为了探讨组装环境对基因载体/DN复合物的粒径和转染效果的影响,在三种不同离子浓度溶液体系(PBS, 5% 葡萄糖溶液, H2O)中测量BDCP(biodegradable cationic polymer,一种生物可降解的阳离子聚合物)/DNA复合物粒径和结合力,进行了体外转染试验和毒性试验.结果显示,PBS最适合组装转染复合物,可取得更好的稳定性、最高的转染效率和较低细胞毒性、低溶血率;在5%葡萄糖溶液和水中组装的BDCP/质粒复合物结合力较弱,转染效率比较低.得出结论,BDCP/DNA粒径、结合力和基因转染效率受组装体系的离子强度影响.  相似文献   

3.
通过优化细胞转染条件,探讨脂质体与DNA的复合比例、复合时间以及转染时间对脂质体介导的基因转染效率的影响。实验采用凝胶阻滞电泳分析脂质体完全包裹DNA时二者的复合比,通过转染绿色荧光蛋白报告基因(pEGFP)研究脂质体/pEGFP的复合比例、复合时间对细胞转染效率的影响。激光扫描共聚焦成像进一步分析转染时间对细胞摄取DNA量的影响。实验结果表明,脂质体和DNA的复合比例为1.25时,细胞的转染效率最高。转染4 h后,大量DNA被细胞摄取,此时可以更换新鲜的培养基。  相似文献   

4.
脂质体转染人肝星状细胞和肝细胞条件优化   总被引:1,自引:0,他引:1  
利用Lipofectamine 2000(Lipo)介导LacZ及EGFP基因转染人肝星状细胞系LX-2和人肝细胞系Chang Liver,探讨Lipo用量、质粒用量、转染时间、细胞初始接种密度及不同启动子驱动对转染效率的影响.结果显示,两种细胞均能得到高效转染,Chang Liver细胞转染效率(80%)高于LX-2细胞(60%).Lipo用量为每孔2μL,转染后6 h换液,LX-2细胞应用质粒DNA为每孔0.45μg,Chang Liver细胞应用质粒DNA为每孔0.30~0.45μg,此时转染效率最高.巨细胞病毒(CMV)启动子驱动LacZ转染效率与CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染效率无显著差异;细胞初始接种密度对转染效率无显著影响.  相似文献   

5.
为了对组氨酸修饰的阳离子聚合物载体进行研究,重点考察其基因转染效率与细胞毒性,探讨其作为基因载体的可能性。采用自由基聚合法合成聚乙二醇-聚谷氨酸-聚乙烯亚胺-组氨酸(PEG-b-PLG-g-PEIsHISs,GGIS)聚阳离子载体,用1H-NMR表征载体材料结构;通过凝胶电泳实验研究载体对质粒DNA的压缩能力,粒径分析仪测定载体结合DNA后在不同N/P比条件下的粒径及表面电荷;用MTT法测定载体在HEK293T,Hela,BEL7402和A549等细胞株上的细胞毒性,考察GGIS体外细胞转染效率。结果显示在N/P≤30时,载体材料的平均粒径在100~200 nm,表面电荷在10~30 m V,适合细胞吞噬。体外细胞毒性表明,GGIS的细胞毒性较PEI 25K低。GGIS具有较强的DNA缩合能力,且有较好的体外基因转染能力。因此,GGIS有较好的体外基因转染能力,能够携带报告基因在体外有效表达,是具有应用前景的非病毒性基因药物载体。  相似文献   

6.
研究了新型阳离子聚合物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的性能,重点考察其粒度,基因转染效率与细胞毒性,探讨了其作为基因载体的可能性.通过动态光散射仪(DSL)、透射电镜(TEM)观察了Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH与DNA自组装形成的颗粒形态及粒径,Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH可复合DNA形成粒径160~210 nm的纳米复合物,适合进入细胞.使用MTT比色法分析Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的毒性并与PEI,PEI-g-PEG-OH比较.选用增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 转染Hela细胞,应用流式细胞术检测转染效率.新型阳离子多聚物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH在提高基因转染效率的同时降低了其细胞毒性,有望成为基因转移的有效载体.  相似文献   

7.
聚乙烯亚胺(PEI)是一类新兴的阳离子多聚物非病毒载体,可缩聚DNA分子形成颗粒并转入真核细胞进行表达.本文选用分子量750 ku分枝状PEI与分子量25 ku线性PEI转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因于HeLa细胞,并对这两种PEI的转染效率进行比较.利用MTT法检测比较线性PEI与分枝状PEI的细胞毒性.通过凝胶阻滞实验比较两种PEI结合DNA能力.最后利用肝素介导释放实验比较两者在形成PEI/DNA复合物后释放DNA的能力.研究结果表明:线性PEI转染效率优于分枝状PEI,且随PEI/DNA质量比的增加而升高,而分枝状PEI则相反;两种PEI细胞毒性在一定范围内相近;分枝状PEI结合DNA能力略强于线性PEI;但是分枝状PEI释放DNA的能力远小于线性PEI.这可能导致DNA在细胞内无法从PEI/DNA复合体上释放出来,从而影响转录的正常进行,最终导致分枝状PEI转染效率下降.  相似文献   

8.
目的:合成羟丙基β-环糊精偶联小分子量聚乙烯亚胺的共聚物,探讨不同聚乙烯亚胺偶联率的共聚物缩合DNA的能力,探讨不同偶联率的阳离子共聚物组成与转基因效率的关系。方法:通过NMR表征,凝胶阻滞DNA试验考察其缩合DNA能力,以MTT法检测不同偶联率共聚物的细胞毒性。以不同的偶联率共聚物为载体,在不同的N/P比值条件下,将荧光素酶基因导入非洲绿猴肾细胞COS-7,通过荧光素酶的表达检测比较不同偶联率的共聚物转染效率。结果:合成的不同偶联率的共聚物缩合DNA能力不同,转染效率也不同。结论:聚乙烯亚胺偶联率较高的阳离子共聚物缩合DNA的能力较强,转染效率较高。  相似文献   

9.
通过构建以MDR1启动子为启动序列的荧光素酶报告基因载体,建立基于双荧光素酶报告基因系统的多药耐药抑制剂筛选模型。从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子的序列。将该序列重组到荧光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中,建立用于筛选多药耐药抑制剂的方法。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。通过MDR1基因激活剂(热诱导)和抑制剂(EGCG)来验证该方法。通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子序列且没有出现碱基突变。在n(pGL-MDR1)∶n(pRL-TK)=5∶5时,转染效率最高并具有最高的荧光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。  相似文献   

10.
基于Zn(II)-二甲基吡啶胺(Zn-DPA)合成了含十六烷基醇疏水性尾部的单/双核金属阳离子脂质6a-6b.通过凝胶电泳、溴乙锭置换和粒径电位实验考察了它们与质粒DNA的相互作用.结果表明,两个金属脂质均可将DNA包裹缩合成具有适当粒径大小和zeta电位的纳米颗粒.并且,双核金属脂质6b具有比单核脂质6a更强的DNA结合能力.MTT细胞毒性实验显示金属脂质体/DNA复合物具有较低细胞毒性(细胞存活率大于80%).体外基因转染研究表明,单核金属脂质6a的转染效率优于双核金属脂质6b.  相似文献   

11.
用调 Q Nb:YAG激光器输出的波长为 355 nm的三倍频光进行人胃癌细胞基因转移的研究。激光束经显微镜的物镜聚焦,在样品平面上获得激光微束。钙黄素和荧光 IgG用来模拟 DNA分子。激光微束照射细胞,在细胞膜上打出一个可以自行恢复的小孔,同时,荧光物质通过小孔扩散到被照射的细胞内。在荧光显微镜的蓝光激发下,被照射的细胞发绿光。激光能量每个脉冲大约是 200 μJ.脉冲数 1~4,脉冲宽度小于 10ns。  相似文献   

12.
13.
Transfection of the CD8 gene enhances T-cell recognition   总被引:6,自引:0,他引:6  
Antibodies against CD8 or CD4 antigens can prevent T-cell functions induced by T-cell targets. As CD8 or CD4 antibodies can also initiate negative signals in T cells in the absence of appropriate targets it is not clear whether CD8 and CD4 molecules are directly involved in the interaction of T cells with their targets. In previous experiments we have introduced the T-cell receptor alpha- and beta-chain genes from a CD8-positive cytolytic T cell specific for the antigen fluorescein (FL) and the H-2D molecule of the major histocompatibility complex (MHC) into a CD8-negative recipient cell. The CD8-positive donor cell lysed both FL-conjugated fibroblasts and lymphoblasts, which express relatively high and low amounts of H-2D molecules, respectively. In contrast the CD8-negative transfectant lysed FL-conjugated fibroblasts only. Here we show that recognition of FL-conjugated lymphoblasts by the transfectant is enhanced by supertransfecting it with the CD8 gene.  相似文献   

14.
电融合和电导入技术是八十年代发展起来的一种新的生物技术。其转换率是用化学方法所得不到的。LN-101基因脉冲导入仪能提供2500伏脉冲电压和160安培电流。无论在高阻的和低阻的介质中(如盐和蔗糖缓冲剂)均能使用该仪器。  相似文献   

15.
作者就本实验室分离到的一株对钝齿棒状杆菌B_9具有转导作用的噬菌体T_1,研究了噬菌体DNA的转染条件、钝齿棒状杆菌球状体的制备条件与转染频率的关系.证明以1%甘酸氨和0.8μ/ml青霉素培养,再经1mg/ml溶菌酶破壁处理10-16h效果较好;比较了各种二价阳离子和PEG对转染频率的效应,30mM CaCl,和16%PEG结合处理可提高转染频率,单独加Ba~( )或PEG,对转染无作用,二者结合处理有作用;加小牛血清白蛋白及37℃加温处理5min可提高转染频率,最适条件下,高达9.5×10~(-3)p.f.u./cell(2.8×10~6p.f.u./μg DNA)。噬菌体T-1对钝齿棒状杆菌是专一的,但以它的DNA对其它一些棒状杆菌也能转染,表明噬菌体T-1的受点与细胞壁有关.  相似文献   

16.
通过比较293T细胞的接种密度、质粒DNA的量以及CO2浓度对磷酸钙转染方法的影响,确定最佳的转染条件.以各单因素试验的最适条件为依据,设计三因素三水平的正交试验.结果表明,磷酸钙介导质粒DNA转染,当293T细胞的接种密度为5×105/mL、质粒DNA的量为30μg、细胞培养环境CO2浓度为3%时,转染效果最佳.  相似文献   

17.
应用电穿孔技术转染pEGFP于哺乳动物细胞,讨论了电穿孔技术的应用条件,影响因素,初步确定了COS7、Hela、HepG2、K562、Jurkat等细胞系的转染条件,为今后的分子生物学研究打下了良好的基础。  相似文献   

18.
摘要:目的 比较不同血清型腺相关病毒( AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9) 对背根神经节( DRG) 初级感觉神经元的转导效能。 方法 将 24 只雄性 SD 大鼠随机分为 8 组,分别通过 DRG 直接注射不同血清型腺相关病毒( AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9)载体,各组大鼠分别在转染后第 3 周和第 4 周取材,并在共聚焦显微镜下观测对大鼠 DRG初级感觉神经元的转染效果。 结果 组织切片的荧光结果显示,腺相关病毒各亚型的转染效果如下:转染 3 周,AAV9> AAV6> AAV8 > AAV5;转染 4 周,AAV9> AAV6> AAV8> AAV5。 其中,AAV9 载体对大鼠 DRG 神经元的转导效果较好。 结论 DRG 注射不同血清型腺相关病毒( AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9) 载体,AAV9 对 DRG 神经元的转导效能最佳。  相似文献   

19.
对一种哺乳动物的非贴壁细胞———BALB/C近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株P815进行了G418敏感浓度以及甘油耐受性的测定;并通过磷酸钙法用含HCVC、E1、E2基因以及筛选标记基因———neor基因的质粒pRc/CE2进行了转染。经G418筛选,获得了G418抗性细胞:P815-CE2。目前,P815-CE2细胞在G418选择压力下,已连续筛选80余天,成功传代12次,提示转染获得成功。实验表明:被转染细胞是否贴壁,不是决定磷酸钙法转染成功与否的决定因素;为了制备符合转染要求的合适的磷酸钙———DNA混合物,所需各试剂的用量应该被优化。  相似文献   

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