马尾松银松素合酶基因转化双子叶植物表达载体的构建及鉴定

以马尾松为材料,在获得马尾松银松素合酶基因的基础上,构建了该基因转化双子叶植物的表达载体,该表达载体含有35S启动子和NOS终止子,能启动基因在双子叶植物中高效地表达.设计并合成分别含有Bgl和BstE酶切位点的上下游引物,通过PCR反应扩增出含有该酶切位点的银松素合酶基因cDNA全序列,酶切后连接到pCAMBIA1301植物表达载体上.经PCR鉴定、酶切分析及DNA测序证实cDNA片段大小、序列以及读码框的正确性.最后通过电击将表达载体转化农杆菌LBA4404,为进一步研究银松素合酶基因的功能奠定基础.     

钙离子对灌浆期藜麦淀粉及其合成酶活性的影响

研究钙离子对藜麦籽粒中淀粉合成的影响.以LL-3,H-1藜麦为实验材料,以Hoagland营养液为对照,以Hoagland营养液加硝酸钙溶液进行高钙溶液处理,以缺钙的Hoagland营养液加钙离子螯合剂进行低钙处理,对灌浆期藜麦籽粒中的淀粉含量和淀粉合成关键酶的活性进行测定.结果表明,LL-3在高钙处理下,可明显提高其支链淀粉和直链淀粉的含量,而低钙处理下直链淀粉的含量降低,支链淀粉的含量无显著变化.淀粉合成相关酶在高钙处理下的峰值时间不变,平均酶活性与正常组相比有明显提高.低钙处理下,蔗糖合成酶(SS),可溶性淀粉合成酶(SSS)的活性峰值时间均提前,结合态淀粉合成酶(GBSS)、淀粉分支酶(SBE)的活性峰值时间与正常组一致,籽粒提前成熟衰老,淀粉含量减少.H-1在高钙处理下,直链淀粉和支链淀粉的含量无显著变化,而低钙处理下支链淀粉和直链淀粉的含量降低.在低钙处理下,SS,SSS,GBSS与正常组相比,其活性峰值时间均提前,高钙处理下,平均酶活性与正常组相比明显提高.钙离子对藜麦籽粒中淀粉的积累有重要的调节作用.     

小麦蜡质突变体Wx蛋白突变基因的分子鉴定

蜡质型小麦面粉对于改善面食品的加工品质、适口性、风味特点和延长货架寿命具有重要意义.淀粉粒结合型淀粉合酶I被称为蜡质蛋白(Waxy Protein,简称为Wx蛋白),是决定胚乳中直链/支链淀粉比例的关键酶.Wx基因发生突变并不影响产量等其它性状的表现.小麦三个Wx基因位点中Wx-D1的天然突变型遗传资源非常稀有.本实验对EMS诱导扬麦158的6个蜡质型突变体及其子代系进行了基于PCR的遗传多态性分析、单粒种子Wx蛋白SDS-PAGE电泳鉴定、PCR产物的克隆分析.利用自行设计的引物为5个突变体子代找到了STS标记;查明了两个突变体突变位点及其突变方式,是新的突变方式.     

不同直链淀粉含量水稻籽粒淀粉积累及其相关酶的活性变化研究

以4个不同直链淀粉(AC)含量水稻品种为研究材料,研究籽粒淀粉积累规律及其相关酶的活性变化,并分析了两者之间的相关性.结果表明直链淀粉积累速率、支链淀粉积累速率、颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)和可溶性淀粉合成酶(SSS)活性均呈单峰曲线变化.所有水稻品种直链淀粉含量在花后5～15 d增幅最大;支链淀粉含量在花后5～20 d有一个极显著增加的过程,B6优4761增幅最大.Logistic方程拟合淀粉积累过程发现,直链淀粉积累量的高低主要取决于最大积累速率的高低,而最大积累速率出现的早晚和活跃积累天数的长短决定了支链淀粉积累量的高低.高AC含量品种菲优188直链淀粉积累量、积累速率及GBSS活性最大值显著大于其它水稻品种;糯稻品种成糯88在花后15 d的支链淀粉积累量和积累速率最大,但其籽粒SSS活性较低.灌浆后期,高AC含量品种菲优188的籽粒千粒重明显大于其余水稻品种.相关分析表明,所有水稻品种籽粒淀粉积累速率均与GBSS、SSS活性呈正相关,说明籽粒淀粉积累量的高低还受到GBSS和SSS活性的影响.     

采用次乙亚胺诱发水稻蜡质和非蜡质突变体

水稻的粘性或蜡质胚乳是由支链淀粉组成,而非蜡质类型却由直链淀粉和支链淀粉组成。淀粉的蜡质类型,只能在胚乳或花粉粒中发现,且受单一隐性基因控制。至今,已有几篇介绍用辐射和化学诱变剂处理玉米和大麦成功地诱发蜡质突变体的报告。可是,在水稻上大概还没有人工诱发蜡质突变体的报道。作者试用次乙亚胺(Ethylene imine,简写 EI)来诱发水稻     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

产辅酶Q10大肠杆菌工程菌的构建

克隆放射型根瘤菌ddsA基因,用于构建red重组的打靶片段,通过同源重组替换大肠杆菌基因组上的ispB基因,使合成辅酶Q8的大肠杆菌具备合成辅酶Q10的能力.通过强化辅酶Q合成过程中的ddsA、ubiA、ispA、idi等关键酶基因,可使大肠杆菌辅酶Q10的合成能力提高126.9%.综合分析表明,ddsA与ubiA为辅酶Q10合成的关键基因,ispA与idi为辅酶Q10合成的次关键基因.     

小麦AGPase胞质型小亚基SSUⅠ的克隆及过表达反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶AGPase胞质型小亚基（AGPase plastic small subunit,SSU Ⅰ）的cDNA全长,并构建了此基因的过表达、反义表达和RNAi干扰载体.SSUI的cDNA全长为1465 bp（GenBank No.EF405961）,编码域长度为1 422 bp,位于EF405961的2～1 423 bp.同源性比较结果表明：与GenBank上已报道的SSU I基因（X66080,AF244 997,Z48562）同源性达98%～99%.以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的SSU I基因的过表达载体pWM101SSU Ⅰ S;将该基因反向置于pBI121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了SSU Ⅰ的反义表达载体pBI121SSU Ⅰ A.同时还克隆出SSU Ⅰ基因的一段260 bp高保守序列,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGC5941SSU Ⅰ.     

小麦AGPase胞质型小亚基SSU I的克隆及过表达反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶AGPase胞质型小亚基(AGPase plastic small subunit,SSU I)的cDNA全长,并构建了此基因的过表达、反义表达和RNAi干扰载体.SSU I的cDNA全长为1465 bp(GenBank No.EF405961),编码域长度为1 422 bp,位于EF405961的2～1423 bp.同源性比较结果表明:与GenBank上已报道的SSU I基因(X66080,AF244997,Z48562)同源性达98%～99%.以pWM101质粒为基础,构建了由35S启动子调控的SSU I基因的过表达载体p.WM101SSU I S;将该基因反向置于pB1121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了SSU I的反义表达载体pBI121SSU I A.同时还克隆出SSU I基因的一段260 bp高保守序列,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGC5941SSU I.     

导入反义蜡质基因降低两系不育系稻米直链淀粉含量

为了提高两系不育系261S水稻的选配范围，研究利用根癌农杆菌介导法将蜡质基因反义片段导入261S未成熟种子形成的愈伤组织，经抗性筛选及PCR检测获得46棵T0代转基因植株．采用GUS染色追踪分析获得转反义蜡质基因纯合的T2代转基因植株．10个转基因植株糙米经直链淀粉含量分析显示：未转基因261S对照水稻糙米直链淀粉平均含量为18．54％，大部分转基因后代糙米直链淀粉含量有不同程度的降低，降低程度最大的转基因后代糙米直链淀粉平均含量为13．55％，比对照降低26．91％．开展本研究可为两系杂交稻优质育种奠定基础．     

褐飞虱羧酸酯酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱羧酸酯酶基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为396 bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自铜绿蝇、家蝇、沟鼠、黑腹果蝇、线虫和埃及伊蚊的羧酸酯酶的片段存在高度同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,羧酸酯酶基因表达水平明显升高.以上结果表明,羧酸酯酶基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在有毒化学物质解毒及增强褐飞虱对抗性水稻的耐受性方面可能起着重要作用.     

褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kDa亚基cDNA片段的克隆及表达分析

NADH泛醌氧化还原酶是动物体内呼吸链电子传递系统的第一个酶，克隆水稻害虫褐飞虱的NADH泛醌氧化还原酶基因，及研究其在褐飞虱与水稻互作中的表达变化，将为科学防治褐飞虱提供新的线索。利用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术克隆了褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kDa亚基基因的cDNA片段，并进行了序列测定；使用NoRhem杂交技术检测了该基因对两种不同抗性水稻的分子反应。分子杂交结果表明，在取食抗性水稻品种B5后，褐飞虱的NADH泛醌氧化还原酶51kDa亚基基因表达水平明显升高，而取食感虫水稻TN1后，该基因的表达水平没有明显变化。     

Cloning and characterization of a glucose 6-phosphate／phosphate translocator from Oryza sativa

Plastids of nongreen tissues import carbon as a source of biosynthetic pathways and energy, and glucose 6-phosphate is the preferred hexose phosphate taken up by nongreen plastids. A cDNA clone encoding glucose 6-phosphate/phosphate translocator (GPT) was isolated from a cDNA library of immature seeds of rice and named as OsGPT. The cDNA has one uninterrupted open reading frame encoding a 42 kDa polypeptide possessing transit poptide consisting of 70 amino acid residues. The OsGPT gene maps on chromosome 8 of rice and is linked to the quantitative trait locus for 1000-grain weight. The expression of OsGPT is mainly re-stricted to heteretrephic tissues. These results suggest that glucose 6-phosphate imported via GPT can be used for starch biosynthesis in rice nongreen plastids     

水稻苹果酸脱氢酶基因的克隆及其在E.coli中的表达

以玉米苹果酸脱氢酶的基因为探针，从水稻幼苗cDNA文库筛选得到一条水稻新基因，它与玉米ZHO2序列的一致性高达87％，被命名为RcMDH(rice cytoplasmic malic dehydrogenase gene)，分析发现RcMDH具有完整的读码框，编码332个氨基酸，预计分子质量为36．5ku,导入大肠杆菌中表达，经检测证实该产物具苹果酸脱氢酶酶活性。     

Antisense expression of a rice cellular apoptosis susceptibility gene (OsCAS} alters the height of transgenic rice

Cellular apoptosis susceptibility (CAS) gene plays important roles in mitosis, development and export of importin a from the nucleus, but its function in plant is unknown. In this study, a rice CAS ortholog (OsCAS), which encodes a predicted protein of 983 amino acids with 62% similarity to human CAS, was identified. DNA gel blot analysis revealed a single copy of OsCAS in the rice genome. A 973 bp fragment at the 3' end of OsCAS cDNA was cloned from rice cDNA library and transferred into rice in the antisense direction under the control of CaMV 35S promoter via Agrobacterium-mediated transformation method, 105 transgenic lines were obtained. Expression of OsCAS was suppressed in the antisense transgenic lines as revealed by semi-quantitative RT-PCR. The antisense transgenic lines showed dwarf phenotypes. The results indicated that OsCAS was involved in culm development of rice.     

Isolation ofosRACD gene encoding a small GTP-binding protein from rice

Using an improved version of mRNA differential display technology, we have obtained a differentially displayed fragment RDP-8. Homologous comparison indicated that the fragment RDP-8 has high homology with the gene encoding maize small GTP-binding protein. By screening cDNA library of the rice Nongken 58N pan icle using the newly obtained fragment RDP-8 as probe, we further found the full-length cDNA of osRACD gene that encodes a rice small GTP-binding protein. Asco mpared with maize RACD gene, the osRACD of rice shows remarkable homology in both nucleotide sequence and amino acid sequence, 88% and 97% respectively. Evidence from RT-PCR study indicates that osRACD gene is related to photoperiod fertility conversion of photoperiod sensitive genic male sterility (PSGMS) rice.     

Antisense expression of a rice cellular apoptosis susceptibility gene (OsCAS) alters the height of transgenic rice

Cellular apoptosis susceptibility (CAS) gene plays important roles in mitosis, development and export of importin α from the nucleus, but its function in plant is unknown. In this study, a rice CAS ortholog (OsCAS), which encodes a predicted protein of 983 amino acids with 62% similarity to human CAS, was identified. DNA gel blot analysis revealed a single copy of OsCAS in the rice genome. A 973 bp fragment at the 3′ end of OsCAS cDNA was cloned from rice cDNA library and transferred into rice in the antisense direction under the control of CaMV 35S promoter via Agrobacterium-mediated transformation method, 105 transgenic lines were obtained. Expression of OsCAS was suppressed in the antisense transgenic lines as revealed by semi-quantitative RT-PCR. The antisense transgenic lines showed dwarf phenotypes. The results indicated that OsCAS was involved in culm development of rice.     

合系35×老来红联合世代耐低磷性状主基因加多基因遗传研究

 磷高效水稻培育是提高土壤潜在磷利用效率的一种途径,用云南主栽粳稻品种合系35与云南稻种核心种质耐低磷特性极强老来红配制P1,P2,F1和F2世代,在云南省农科院(海拔1916 m)种植两处理(有效磷质量比6.26 mg/kg,有效磷40 mg/kg)耐低磷鉴定,采用数量性状的主基因-多基因混合遗传模型,研究了水稻的分蘖、株穗重和总干重3个耐低磷指标性状的遗传,结果表明,分蘖、株穗重和总干重3个耐低磷指标性状在这个组合中都表现为一对主基因加多基因遗传和多基因遗传2种遗传模式.