A型肉毒杆菌毒素的基因测序与分析

对国内A型肉毒杆菌毒素基因测序,分析了解毒素基因结构并推测其氨基酸序列。提取肉毒杆菌总DNA,利用自行设计的引物对目的基因进行PCR扩增,把目的基因导入E.Coli JM109,筛选含目的基因的阳性克隆菌进行测序和分析,从而了解毒素基因结构并推测其氮基酸序列。对A型肉毒杆菌毒素基因的核苷酸序列成功测序并与GenBank中的相应序列比较,其序列同源性为96％。推测其氨基酸序列同源性为100％。成功地对A型肉毒杆菌毒素的基因进行了测序,这为肉毒杆菌毒素中毒的快速诊断,以及进一步探求以基因工程方法生产此毒素奠定基础。     

野生－粒小麦着丝粒RCS1相关序列的克隆鉴定

用水稻着丝粒重复序列RCS1为探针，与3072个克隆进行菌落杂交，得到了32个阳性克隆，用RCS1与拟斯卑尔脱山羊草着丝粒重复序列Tcs250为探针进一步筛选，在32个RCS1相关的阳性克隆中任选10个克隆进行点杂交，分别有6个和5个阳性克隆．为了克隆RCS1相关片段，依据RCS1的序列设计了三对引物，将引物3从上述阳性克隆中扩增的一个543bp的片段克隆测序，发现与水稻RCS1部分片段达到约83％的同源，与大麦的反转座子(Ty3／gypsy)部分序列同源性达到了92％，与节节麦中着丝粒的整合酶基因部分序列同源性达到了96％，命名为TBRCS1．TBRCS1可能是野生一粒小麦着丝粒区的组成部分．     

嗜麦芽黄单胞菌CG样受体跨膜域克隆与分析

根据已知生物LH/CG受体同源性较大的跨膜域序列设计引物，以嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，将约600bp目的产物克隆到pUCm-T载体上，经酶切及PCR扩增筛选鉴定得到重组质粒pUCm-Rec，以DIG标记的PCR扩增片段作为探针进行DNA斑点杂交，确证目的PCR扩增片段与该菌染色体DNA有同源性，克隆到的593bpCG样受体跨膜域序列在GenBank中的注册号为AY355346，再以地高辛标记的593bp跨膜域序列为探针，从构建的该菌基因组文库中，筛选到可能与CG样受体属于同一跨膜受体家族的编码组氨酸激酶／效应调节杂合蛋白部分序列的685bp核酸片段(其在GenBank中的注册号为AY359445)。     

新疆加工番茄条斑坏死病原黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从表现花叶、畸形以及坏死症状的加工番茄病株上获得黄瓜花叶病毒分离物，用1对CMV CP基因引物进行RT-PCR，扩增得到了776bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物插入到克隆载体PUCm-T中转化大肠杆菌DHSa。经限制酶酶切鉴定，重组克隆中含有与PCR产物大小相同的776bp的插入片段。cDNA全序列分析表明，重组克隆含1个开放阅读框架（ORF），长度为657nt，编码218个氨基酸组成的蛋白。与国内外报道的CMV株系序列比较，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的核苷酸同源性高达91．0％-98．9％．而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在76．4％-78．2％，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的氨基酸同源性高达94．2％-98．6％；而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在79．9％～83．5％．CMV亚组Ⅰ的株系较CMV亚组Ⅱ株系同源关系更密切，所以CMV新疆分离物应该归属于CMV亚组Ⅰ。     

牙鲆、石鲽和川鲽的线粒体16S rRNA基因片段的序列比较研究

以相应引物对牙鲆（Paralichthys olivaceus)和石鲽（K.areius bicoloratus)的线粒体16S rRNA基因片段进行了PCR扩增,PCR产物经T载体连接之后进行了克隆、测序,均得到了590bp的碱基序列,并将其与GenBank中牙鲆线粒体全序列相应片段和川鲽（Platichthys flesus)相应片段进行比较,结果表明,川鲽和石鲽序列差异很小（核苷酸差异数为7,同源性为98．8％）;而牙鲆与川鲽和石鲽的序列差异明显（核苷酸差异数为90－93,同源性约为84％）,且大多数核苷酸变异位点集中在序列中部大约200bp的区域。     

桃抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已克隆的STK类抗病基因的保守区设计简并引物对4个不同桃的基因组DNA进行PCR扩增,将获得的扩增片段的回收产物,应用pGEM-T easy裁体试剂盒进行了目的基因片段的克隆.随机挑取若干单克隆经PCR鉴定确认后,进行测序,共获得11个各不相同的片段序列.氨基酸序列分析中,有6个片段能推导出完整的氨基酸序列.除了两侧都基本具有STK类抗病基因产物的保守结构域.     

基于ActA基因的单核细胞增多性李斯特菌的序列分型研究

根据单核细胞增多性李斯特菌ActA基因序列保守区设计一对引物，对21个菌株进行PCR扩增，得到长度为820bp的片段。PCR产物经过纯化后直接测序，并对其中的506bp进行同源性分析。结果表明单核细胞增多性李斯特菌分离株具有5个明显不同的克隆谱系，每个谱系的同源性均在95％～100％。16个单核细胞增多性李斯特菌奶相关和环境分离株可被分成4个谱系，其中2个谱系（C、D）均为奶相关分离株和成品奶分离株；加工厂地面污水分离株为独立的一个谱系。初步表明，成品奶中污染的单核细胞增多性李斯特菌来自于奶牛场，而非加工环境。     

禽巴氏杆菌抗链霉素耐药基因StrA的克隆及同原性比较

根据巴氏杆菌基因序列设计合成一对引物，以临床分离的动物源性巴氏杆菌抗链霉素耐药菌株为模板，通过PCR技术，扩增出StrA基因350-1153bp序列．PCR产物及表达载体通过粘端连接，将长约804bp的StrA目的基因片段克隆到pGEM—T载体上，构建了克隆载体质粒pGEM—TstrA．StrA基因片段测序结果与文献报道的结果同源性为99．8％．只有一个碱基发生突变，但所编码的氨基酸没有改变．     

黑线仓鼠MHCⅡ类DQA基因外显子2的克隆与序列分析

为了探明黑线仓鼠MHC的结构与功能并寻找分子标记，对MHCⅡ类DQA基因的外显子2进行克隆和序列分析．提取黑线仓鼠3个群体（吴村、沂南和临朐）的基因组DNA构建基因池，利用PCR技术扩增得到249bp的片段，将该目的片段连接到pMD18-T载体中，重组质粒转入大肠杆菌DH5α后利用蓝白斑法筛选阳性克隆，测序后得到该目的片段的核苷酸序列（Genbank登录号：FJ209306）并推导出氨基酸序列．结果表明：黑线仓鼠、人类、大鼠、小鼠、猪、马、牛、兔之间DQA基因外显子2的核苷酸序列同源性为68．7％-85％，氨基酸序列同源性为56．8％-83．5％，黑线仓鼠与大鼠、小鼠亲缘关系更近．测序得到的OQA基因外显子2的序列在物种间具有丰富的多态性，可以作为物种遗传分析的分子标记．     

家蚕质多角体病毒基因部分序列克隆及分析

根据BmCPV(Bombyx mori cytoplasmic polyedrosis virus)核酸片段4的末端序列设计一对引物，通过RT－PCR扩增获得多条DNA片段，对其中占优势的约740bp的片段进行切胶回收，克隆到pGEM-Teasy载体上并进行序列测定。与GenBank中的database比较分析表明，该序列与已登录的序列同源性很低，并与呼肠弧病毒科其它种的对应核酸序列有较大差异。本实验证明所测序列为一新序列。     

野生一粒小麦着丝粒RCS1相关序列的克隆鉴定

用水稻着丝粒重复序列RCS1为探针 ,与 30 72个克隆进行菌落杂交 ,得到了 32个阳性克隆 ,用RCS1与拟斯卑尔脱山羊草着丝粒重复序列Tcs2 5 0为探针进一步筛选 ,在 32个RCS1相关的阳性克隆中任选 10个克隆进行点杂交 ,分别有 6个和 5个阳性克隆 .为了克隆RCS1相关片段 ,依据RCS1的序列设计了三对引物 ,将引物 3从上述阳性克隆中扩增的一个 5 4 3bp的片段克隆测序 ,发现与水稻RCS1部分片段达到约 83%的同源 ,与大麦的反转座子 (Ty3 gypsy)部分序列同源性达到了 92 % ,与节节麦中着丝粒的整合酶基因部分序列同源性达到了 96 % ,命名为TBRCS1.TBRCS1可能是野生一粒小麦着丝粒区的组成部分     

PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进

分析了常规PCR扩增鉴定阳性克隆实验中存在的问题,进行了改进探索:反转录PCR(RT-PCR)获得目的基因片段,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌感受态细胞;利用目的基因的特异性引物,用菌液PCR法直接筛选重组克隆,在筛选的阳性菌液中扩增到与目的基因片段大小一致的阳性条带,与质粒PCR及酶切的阳性对照一致,验证了菌液PCR具有可靠性。实验证明,自身引物菌液PCR法用于定性筛选重组阳性克隆,是一种简便、快速、有效的方法。     

古矿井区域酸性矿坑水微生物群落的多样性

通过生态群落16S rRNA基因库的重建并采用限制性酶切长度多态性(RFLP)分析的方法,对铜绿山铜矿酸性矿水中微生物群落的多样性进行研究。通过RFLP对扩增出的327个16S rRNA PCR产物进行分析,对44个16S rRNA的克隆子进行测序。每个样点各有2～6个主要操作分类单元,这些操作分类单元所对应的克隆子数分别占各样点克隆子总数的56.3%～69.6%。93.8%的克隆子序列与现在的数据库中序列相似性大于90%。样点酸性矿坑水主成分分析与系统发育分析结果显示:在低pH值、高离子浓度的样点tls1与tls2中多数克隆子属于gamma-Proteobacteria(主要为Acidithiobacillus ferrooxidans)和Nitrospira科(主要为Leptospirillum);而在较高pH值、低离子浓度的样点tls3的克隆子多属于gamma-Proteobacteria(没有A.ferrooxidans)和alpha-Proteobacteria。在古矿井区域酸性矿坑水中微生物群落的多样性很低,生物地球化学特性相近的酸性矿坑水由具有相近的微生物群落组成。     

A five-fold pig bacterial artificial chromosome library: a resource for positional cloning and physical mapping

A pig BAC library was constructed with genomic DNA from a male Erhualian pig. After partial digestion with Hind III or BamH I the fragments obtained were cloned into the pBeloBAC11 vector. The library consists of 184320 clones which stored in 480 pieces 384-well plates (20 plates per superpool). A two-step 4-dimension PCR screening system was established to screen the positive clones. An average insert size of 128 kb was estimated from 105 randomly isolated clones, which indicates that the library is more than five times of genomic coverage. For the demonstration of the probability to pick out any unique genes or DNA markers from the library, 10 single-copy genes were screened out and the positive clones were yielded between 1 and 8 with an average of 3.6. Positive superpools were obtained for 32 microsatellite markers selected from different regions of pig genome. The number of positive superpools for each marker varies from 1 to 9 with an average of 4.78. This BAC library provides an additional resource for pig physical mapping and gene identification.     

甜菊钙调蛋白基因的克隆及结构分析

钙调蛋白（Calmodulin）是生物细胞内一种重要的调控蛋白，通过其与靶酶的相互作用控制细胞正常的生长发育及细胞对外界环境变化的反应，我们从甜菊顶芽和花芽中提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链，以此为模板，参考GenBank上已发表植物的钙调蛋白基因序列合成5′端和3′端引物，利用多聚酶链式反应（PCR）扩增并克隆得到了甜菊钙调蛋白基因的两个异型基因，序列分析表明，它们均由450个核苷酸组成，编码148个氨基酸，在核苷酸序列上与迄今已知的多种植物钙调蛋白均有很高的同源性，同源率在83％以上，编码的氨基酸序列同源性更同，同源率高达95％以上，这两个基因之间存在差异，其核苷酸序列同源率为85％，编码区的氨基酸序列的同源率为99％，仅在第122个氨基酸由ALA代替了VAL。     

一个新的水稻GST类似蛋白基因XIG的克隆与分析

根据编码一种玉米GST类似蛋白的mRNA In2-1序列设计引物，以水稻cDNA文库为模板，PCR扩增得到一条270bp的DNA片段，以此片段为探针分别筛选水稻根cDNA文库及水稻基因文库，获得一条全长cDNA及其相应的全长基因，并通过测序得到了两者的全序列，该基因编码的蛋白具有GST的典型特征，在水稻中尚未见报道。     

猴空泡病毒(SV40)PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立检测实验猴及生物制品中猴空泡病毒（SV40）的PCR方法。方法根据SV40—776株设计合成三对引物对现有毒株进行PCR扩增并克隆测序。用这三对引物对56份猴肾、肺、脾及10批脊髓灰质炎疫苗进行检测。结果三对引物均扩增出目的片段；56份猴脏器和10批疫苗SV40检测均为阴性。结论56只恒河猴和10批疫苗中未检测到SV40，所设计的三对引物检测结果准确，均可用于检测。     

Screening and Insert Size Analysis of Candidate C-Genome BAC Clones from Brassica napus

Thirty-two C-genome specific candidate bacterial artificial chromosome (BAC) clones were successfully screened from the BAC library by four-dimensional PCR method with the primer pairs of 75 simple sequence repeat (SSR) markers located in the nine C-genome linkage groups of Brassica napus. The screened 32 BAC clones have an average insert size of 114.2 kb with a range of 30-190 kb. They are the first set of C-genome BAC clones screened from B. napus genomic BAC library. The average insert size of this set of BAC clones presented that the constructed BAC library had a high quality. This set of BAC clones can be used as markers to identify individual chromosomes of B. napus C-genome.     

用PCR法检测苏云金杆菌的溶原性噬菌体

根据苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,B.t)溶原性噬菌体G IL01(GenBank Accession Number:AJ536703)的同源序列设计一对引物,用35株B.t标准菌株和生产菌株MZ1(血清型H3 a3b)的过夜培养物作模板,结果有16株菌株包括MZ1能扩增出大小约为750 bp的预期产物,推测这16株菌为溶原菌。MZ1菌株的过夜培养液与指示菌ZK1(血清型H25)混匀并在双层琼脂上培养12 h后出现了滴度为2×107pfu的噬菌斑,从而证明生产菌株MZ1确为溶原菌;又以G IL01同源性较高的其它四个基因设计引物,分别以MZ1的培养物及其溶原性噬菌体基因组为模板进行PCR扩增,结果两者得到几乎一致的带型,进一步证明了生产菌株MZ1为溶原菌,说明利用PCR法检测鉴定苏云金杆菌的溶原性是可行的。比较指示菌方法、直接电镜法和DNA鉴定法,PCR法快速简便,对B.t生产上快速检测其溶原性噬菌体有实用意义。     

Cloning and sequence analysis of a gene encoding polygalacturonase-inhibiting protein from cotton

Polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIP) play important roles in plant defense of pathogen, especially fungi. A pair of degenerated primers is designed based on the conserved sequence of 20 other known pgip genes and used to amplify Gossypium barbadense cultivation 7124 cDNA library by touch-down PCR. A 561 bp internal fragment of the pgip gene is obtained and used to design the primers for rapid amplification of cDNA ends. A composite pgip gene sequence is constructed from the products of 5′ and 3′ RACE, which are 666 bp and 906 bp respectively. Analysis of nucleic acid sequence shows 69.2% and 68.7% similarity to Citrus and Poncirus pgip genes, respectively. Its open reading frame of the gene encodes a polypeptide of 330 amino acids, in which 10 leucine-rich repeats arrange tandemly. A new set of primers is designed to the 5′ and 3′ ends of the gene, which allows amplification of the full-length gene from the cotton cDNA library. Genomic DNA analysis reveals that this gene has no intron.