重组PDOR基因的表达与纯化及部分酶学性质

将dhaT在E.coli BL21(DE3)pLysS中进行表达,并对含有His6标记的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)进行纯化.重组PDOR反应的最适pH值为10.0,最适温度为55℃,其以1,3-丙二醇和NAD+为底物的表观米氏常数Km值分别是15.5,0.23 mmol*L-1.实验表明,Ca2+, Mg2+和Cu2+对酶活性有抑制作用,而Fe2+, Na+, NH+4和Mn2+对酶活性有促进作用;1,3-丙二醇是PDOR适合的氧化底物.     

克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇代谢途径中的酶活变化

考察了不同条件下克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella.pneumoniae)合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的3种关键酶(甘油脱氢酶(GDH)、1,3-PD氧化还原酶(PDOR)及甘油脱水酶(GDHz))的表观酶活变化。结果显示:这3种酶的酶活变化与Klebsiella.pneumoniae的1,3-PD代谢不完全相关。用SDS-PAGE电泳分析上述不同发酵条件下酶活变化,结果显示不同于3种酶的蛋白条带,Mr约为4.0×104位置的蛋白条带有明显的变化,这可能与菌体代谢过程相关,结论有待进一步深入研究。     

Lrrc10蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET-Lrrc10和Lrrc10蛋白表达,利用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切载体pMD18-T-Lrrc10,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a(+),转入E.coli strainDH5α,菌落PCR筛选阳性菌落,提取阳性菌质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E.coli strain BL21(DE3),于37℃振荡培养,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrc10。转入E.coli strain BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrc10;Lrrc10蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

ASP—ChIFN-α融合基因的构建及表达

利用PCR技术从宁夏地方三黄肉鸡肝组织中扩增出α干扰素基因,构建成原核重组表达质粒pET-28a/(ChIFN-α从埃希氏菌属大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出L-天(门)冬酰胺酶Ⅱ(L-Asmraginase,ASP)信号肽基因,并与原核重组质粒pET-28a/ChIFN-α连接,构建成分泌型表达重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α将重组质粒经IPTG诱导5 h.用SDS-PAGE分析表达蛋白含量,并用鸡α-干扰素ELISA(Western-blot)试剂盒检测表达的重组蛋白的特异性.结果表明,包涵体型重组质粒pET-28a/ChIFN-α和分泌型重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α在23 kD处均表达出目的蛋白,蛋白含量分别为27%和38%,pET-28a/ASP-ChIFN-α的蛋白表达含量比pET-28a/ChlFN-α的蛋白表达含量要高出11%,表达的重组蛋白具有特异性.实验实现了鸡α-干扰素成熟蛋白基因的高效表达,筛选出了可应用于临床的鸡α-干扰素高效表达菌株BL21(DE3)(pET-28a/ASP-ChIFN-α).     

PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

人纤溶酶原K1—3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原Krigle 1-3(K1-3)基因插入融合表达载体pET-17b，获得重组质粒pET-K13,转化E.coli BI21(DE3),在IPTG诱导下，人纤溶酶原K1－3基因在E.coli BI21(DE3,pET-K13)中获得高效融合表达，表达量占菌体总蛋白的24％，表达产物以包函体存在，Western blot证明重组 蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性。     

人tumstatin基因的克隆、表达和抗体制备

应用PCR技术从人胎肺cDNA文库中扩增tumstatin基因编码序列,克隆至pET-3c载体构建非融合表达的重组质粒pET-3c-tum,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得高效表达.表达蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、切胶回收后免疫新西兰大白兔,获得ELISA效价高达1∶1 000的特异性兔抗人tumstatin抗血清.     

植物乳杆菌Lactobacillu plantarumY1菌株胆盐水解酶基因(bsh)的克隆及重组表达

经同源蛋白比对分析设计引物,PCR 扩增获得植物乳杆菌Y1菌株bsh基因(975bp),首先克隆至表达载体pET-28a,转化E. coli BL21(DE3)菌株,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示表达的重组蛋白为包涵体.选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA 的E. coli Rosetta(DE3)作为宿主菌,仍旧没有改善表达产物的可溶性.但是,选择含IF2融合蛋白标签的pLS-IF2质粒构建表达载体,SDS-PAGE分析及Western blot 鉴定结果显示表达的融合重组蛋白IF2-BSH具有可溶性.该结果为进一步研究乳酸菌胆盐水解酶的生物活性,结构功能关系的研究奠定了基础.     

集胞藻PCC6803基因sll0853的克隆、优化表达及其结构功能预测

从集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803提取总DNA,利用PCR扩增目的基因sll0853,构建重组T-0853克隆载体和pET-0853原核表达载体.为了提高sll0853在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明sll0853基因蛋白表达的最佳条件.结果表明:目的蛋白在28℃、0.2mmol/L IPTG、诱导6h表达量分别达高峰.通过生物信息学软件预测基因sll0853可能具有裂合酶的功能.     

秀丽隐杆线虫胆固醇7,8-脱氢酶在大肠杆菌中的表达

胆固醇7,8–脱氢酶是参与胆固醇代谢的还原酶,可以将胆固醇转化为7–脱氢胆固醇(合成维生素D3的重要中间体).合成秀丽隐杆线虫的胆固醇7,8-脱氢酶基因daf-36,与具有T7强启动子的载体pET32a(+)连接后,成功构建pET32a-daf-36表达质粒,转入大肠杆菌表达系统E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta(DE3),经过IPTG诱导培养,蛋白质电泳图谱及质谱结果表明此酶得到了高效表达.     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

A组乙型溶血性链球菌DNaseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a( )表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a( )-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coliDH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a( )-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.     

大肠杆菌中插入表达信号肽提高吡咯喹啉醌产量的研究

本文将载体pET-22b的信号肽基因pelb插入pET-28a-pqq的T7启动子和pqq基因之间,得到重组工程菌E.coli-BL21(pET-28a-pelb-pqq),发酵生产吡咯喹啉醌（PQQ）。结果表明PQQ最高产量可达40.73mg/L,比对照菌E.coli-BL21(pET-28a-pqq)提高了24.36%。此外,工程菌和对照菌前3h发酵的单位菌体产量及单位菌体产率均较高,且此后呈下降趋势。而E.coli-BL21(pET-28a-pelb-pqq)在21h后的PQQ产量及生物量均增加,推测PQQ产量与菌体生物量之间存在同促关系。     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.