巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris,P .pastoris)是一种广泛使用的外源基因表达系统 ,该系统不仅具有高效表达、高稳定、高分泌、高密度生长等特点 ,而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等显著优点。该研究对巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作了简要的综述     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究,但在克隆表达过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌N07并提取该菌株的全基因组;通过PCR手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽,前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因NK1,以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2,构建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1和pET30a-NK2,转化E.coli BL21后在大肠杆菌中表达,并进行了活性分析。结果发现,纳豆激酶酶原基因片段NK1能成功表达出有活性的分泌型纳豆激酶;而纳豆激酶基因片段NK2的表达产物为无活性的包涵体。在对NK1和NK2的比较研究后可知,纳豆激酶酶原基因片段NK1能在大肠杆菌中很好的分泌表达,这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。     

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.     

纳豆激酶原基因的克隆及表达

从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因,与质粒PBV220连接,转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定得到一条约1000bp的条带。阳性克隆经温度诱导表达,用SDS－PAGE电泳鉴定,在38kD处有一条明显的带,占菌体蛋白的20％左右,同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在。包涵体经收集、蛋白变性及复性后显示溶血栓活性。     

纳豆激酶基因重组表达载体的构建及其稳定性

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的纳豆杆菌基因组DN中扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到表达载体PBV220上,筛选重组子,通过限制性内切酶和PCR技术分析,初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,用凝块溶解时间法（CLT）测出表达产物具有溶解血栓活性,证明该基因可在大肠杆菌中表达,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明质粒的插入对宿主菌的生长没有太大影响,该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,但结构稳定性较差,SDS-PAGE分析结果表明基因产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12%左右。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其在医学领域的应用

毕赤酵母表达系统是近几年在外源蛋白表达方面应用比较广泛的一套工具,到目前为止,已用这个系统成功表达了200多种来自病毒、细菌、真菌、动植物和人的蛋白,如人白介素、人血清白蛋白、乙肝表面抗原、水蛭素等。本文就巴斯德酵母细胞的基本特性、宿主菌及其质粒、影响外源蛋白表达的因素和在医学上的应用作一综述。     

血小板生成素在毕赤酵母中的表达

以人胎肝cDNA文库为模板,用PCR和DNA重组技术,将TPOcDNA克隆到pGEM     

抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达

采用PCR技术改造抗菌肽AD基因,将其C末端改造为Asn编码,改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZα－A载体上,构建成酵母重组分泌型表达载体,转化毕赤酵母（Pichia pastoris)受体菌GS115中,采用zerocin抗性标记筛选重组转化子,经摇瓶发酵,浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明,改造后的Cecropin AD基因在毕赤酵母中获得了表达,表达产物经α－Factor信号肽引导分泌到胞外,具有较强的杀菌活性。     

葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达

为了获得高效分泌表达葡萄糖氧化酶(GOD)的毕赤酵母,采用黑曲霉来源的GOD基因序列,按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,构建AOX1启动子诱导的分泌表达载体pPIC9K-GOD和重组菌G/GOD,通过提高遗传霉素G418浓度筛选到第1代高拷贝高产量重组菌G/GODM,单位细胞干重胞外产酶水平可达5843.2 U/g,...     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

曲霉属糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

从黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉中提取总RNA,RT-PCR分别获得其糖化酶基因,所得序列在Gen-Bank数据库中注册,注册号分别为AY652617、AY642120和DQ211971.BLAST分析显示,克隆的曲霉属糖化酶基因与GenBank数据库相应序列同源性很高.将这些糖化酶基因与表达载体pPIC9重组后,电转化进毕赤酵母株GS115,均获得了分泌表达糖化酶的酵母工程菌株.甲醇诱导72 h后,糖化酶的分泌量达到最高,分别为(11.6±0.2)、(12.4±0.2)和(10.0±0.2)U/mL.SDS-PAGE显示,分泌表达的糖化酶分子量均约为80 kDa.     

转甲状腺素蛋白基因在毕赤氏酵母中的非融合表达

用限制酶将pSK TTR质粒上TTR基因切下,分别插入分泌型载体pPIC9和pPIC9K.将重组的pPIC9K TTR用BglⅡ酶切后,转化PichiapastorisGS115菌株,筛选获得G418高抗性转化子.转化子经摇瓶发酵,上清液用SDS PAGE检测,有明显的rTTR表达.经DEAE sepharoseF.F.离子交换柱和Superdex75分子筛层析,得到蛋白纯度大于95%的rTTR.经Westernblotting,分子质量和等电点测定等证明,毕赤氏酵母表达的rTTR与人血浆提取的TTR极为相似.     

解淀粉芽孢杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达。SDS-PAGE试验表明:该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达。植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L。     

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达

利用已有的猪胃蛋白酶原AcDNA,构建毕赤酵母pPIC3.5K-pA胞内表达载体.经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得两株高表达的重组子,研究它们在不同pH值、不同诱导时间、不同起始浓度和不同甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低.结果表明:在pH值为7、诱导72h、起始诱导浓度的OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6.46U/mL.     

融合表面抗SA-28基因在Pichia Pastoris酵母系统中的表达

将乙肝病毒表面抗原S-preS1融合基因SA-28插入质粒载体pAO815的EcoR Ⅰ位点中,将其置于Pichia Pastoris酵母AOX1启动子控制下.利用电转化技术,融合基因表达单元连同HIS4基因被整合到受体菌SMD1168基因组中.对得到的工程菌进行发酵和表达产物的研究表明:SA-28基因在该系统中的表达受甲醇诱导调控;SA-28融合基因的表达产物具有S和PreS1的双重抗原性.用CsC1密度梯度离心法纯化了表达产物,融合抗原活性峰位于密度为1.19 mg/cm3的区带.     

融合表面抗原SA—28基因在Pichia pastoris酵母系统中的表达

将乙肝病毒表面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８插入质粒载体ｐＡＯ８１５的ＥｃｏＲ Ｉ位点中,将其置于Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ 酵母ＡＯＸ１启动子控制下,利用电转化技术,融合基因表达单元链同ＨＩＳ４基因被整合到受体菌ＳＭＤ１１６８基因组中。对得到的工程菌进行发酵和表达产物的研究表明：ＳＡ－２８基因在该系统中的表达受甲醇诱导调控;ＳＡ－２８融合基因的表达产物具有Ｓ和ＰｒｅＳ１的双重抗原性。用     

天蚕素A-蜂毒素杂合肽基因表达载体的构建及其分泌表达

根据天蚕素A(cecropin A,CA)N端第1-8个氨基酸残基和蜂毒素(melittin,ME)N端第1-18个氨基酸残基,用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的杂合肽CA(1-8)ME(1-18)基因.DNA序列分析表明,合成的基因与设计的一致.该基因插入毕赤氏酵母整合型质粒pPIC9K中,置于AOX I启动子的控制下,并通过电转化将重组质粒pPIC9K-came导入Pichiapastoris SMD1168宿主菌,在含有G418的YEPD平板上筛选整合型的多拷贝的转化子,转化子在BMMY培养基中经甲醇诱导表达,发现Tricine-SDS-PAGE有明显条带.比浊法初步测定表明,表达产物came对E.coli DH5α具有抗菌活性.     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

大鼠组织型金属蛋白酶抑制剂-1在毕赤酵母中的重组表达

提取SD大鼠肝组织总RNA,通过RT-PCR扩增TIMP-1 cDNA片段.将扩增产物克隆至pUCm-T载体上,PCR、限制性酶切及测序证实后,EcoRI和NotI双酶切pUCm-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,并将阳性克隆进行PCR、酶切和测序分析,构建pPIC9K-TIMP-1表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,为进一步研究TIMP-1功能和作用机理等的研究创造了条件.