小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。     

MiR-218慢病毒表达载体的构建及鉴定

摘要:构建人mir-218-2, pre-miRNA慢病毒表达载体,为研究miR-218在人体的功能及作用机制打下基础。以人hsa-mir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体,PCR扩增引物二聚体,酶切后插入到线性化pGCSIL-GFP慢病毒表达载体中,对重组质粒进行双酶切鉴定,并进行慢病毒的包装与滴度检测。用构建好的慢病毒表达载体感染人胃癌细胞MKN-28,qPCR检测细胞内miR-218表达。结果显示,重组质粒经双酶切分析及转化菌液测序,插入序列正确,慢病毒表达载体感染人胃癌细胞后qPCR检测显示能显著增高miR-218的表达。说明本实验成功构建了hsa-mir-218-2慢病毒表达载体,感染人胃癌细胞后能有效提高miR-218的表达。为进一步研究miR-218在人体的功能及作用机制建立了实验基础。     

Npas4基因过表达慢病毒的构建及其在SK-N-SH细胞的表达

研究旨在构建Npas4基因过表达慢病毒,为进一步深入探索Npas4基因的功能奠定基础。用人工合成大鼠Npas4基因c DNA片段,将其插入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建慢病毒表达质粒p CDH-Npas4。酶切、测序验证质粒后,将p CDHNpas4和辅助质粒共转染包装细胞293T,浓缩上清得病毒颗粒并测定病毒滴度。取病毒颗粒感染SK-N-SH细胞48 h,收集细胞采用Western blotting法检测Npas4蛋白的表达。p CDH-Npas4携载正确Npas4基因,将其包装293T细胞后能产生病毒。病毒滴度为1.05×109TU/m L。相比于转染GFP病毒对照组(GFP)和未转染对照组(control),Npas4重组慢病毒组(Npas4)的细胞Npas4蛋白表达显著增高。成功构建Npas4基因过表达的重组慢病毒载体p CDH-Npas4,并获得高效的重组慢病毒,能将外源Npas4基因导入SK-N-SH细胞,为进一步研究Npas4基因的相关功能奠定了基础。     

DLL3蛋白在人小细胞肺癌细胞中的功能及其机制

为探讨DLL3(human notch ligand delta-like 3)过表达对人小细胞肺癌细胞的影响及可能的作用机制,通过PCR方法扩增人DLL3基因全长序列,并克隆至慢病毒表达载体Lenti-EFS-FLAG-puro而构建人DLL3基因过表达慢病毒表达质粒,酶切及测序鉴定质粒正确。通过慢病毒包装及感染,构建DLL3稳定过表达的人小细胞肺癌细胞株,并通过Western blot验证DLL3蛋白的表达。采用CCK-8法检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖的影响。采用平板克隆实验检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的克隆形成的影响。Western blot检测DLL3过表达对细胞周期相关蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平的影响。结果表明:人DLL3过表达慢病毒表达质粒构建成功; CCK-8实验显示DLL3过表达促进人小细胞肺癌细胞的增殖。平板克隆实验显示DLL3过表达提高人小细胞肺癌细胞的克隆形成能力。Western blot结果表明DLL3过表达增加细胞周期蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平。可见DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖具有促进作用。     

LITAF基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：探讨构建人脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子(LITAF)基因的过表达慢病毒载体的技术方法并检测其体外表达目的基因的水平。方法：设计LITAF基因引物,应用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增LITAF基因片段,应用EcoRI、BamHI酶切LV8载体,通过连接酶将LITAF基因片段连接至线性化的LV8载体上,应用酶切及测序方法鉴定LITAF-LV8重组质粒。将其包装慢病毒后感染293T细胞(人胚肾细胞),观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,验证后感染肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Western-blot鉴定感染后HepG2中LITAF的表达。结果：LITAF基因在慢病毒感染的HepG2细胞中的表达显著高于对照组细胞。结论：成功构建了过表达LITAF的HepG2细胞株,为后期研究提供了实验基础。     

稳定表达Cytoglobin的肝细胞株LO-2的建立及生长增殖的变化

目的:建立过表达细胞珠蛋白Cytoglobin(CYGB)的人肝细胞LO-2稳定株,初步探究CYGB对LO-2细胞生长增殖的影响.方法:采用PCR法扩增CYGB编码基因,并通过GATEWAY克隆技术构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;酶切、测序鉴定后,与包装质粒三质粒共转人肾上皮细胞(HEK293T),收集、浓缩含病毒上清,获得病毒颗粒;感染LO-2细胞并采用流式细胞分选技术筛选稳定细胞株,Western blot检测表达情况;使用CCK-8试剂盒检测过表达CYGB对LO-2细胞增殖的影响,通过流式细胞技术检测过表达CYGB对LO-2细胞凋亡的影响.结果:慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB双酶切鉴定以及基因序列比对鉴定均正确.三质粒共转HEK293T细胞后,荧光显微镜下观察大部分细胞出现绿色荧光;收集病毒颗粒并感染LO-2细胞后,经流式细胞分选技术筛选获得稳定表达CYGB的细胞,Western blot鉴定显示,LO-2稳定株组的CYGB表达条带明显,阴性对照组未出现条带.CCK-8法绘制的细胞生长曲线显示,稳定表达细胞组的细胞生长速率低于阴性对...     

神经网络的自旋玻璃体模型中的高阶相关

讨论神经网络的自旋玻璃体模型,首先从一个集合选出接近一个初始神经组态的图形,然后假定神经网络动力学中的神经组态,经转换神经元实现这个假设,来自干扰图形的噪声影响许多亚稳态的状况,大数目N的神经元网络存储多个图形,其大小是N个二进制数,对n＝3,网络能量最小,这个能量函数可描述三自旋相关的自旋玻璃体系,在神经元N＝20网络对不同阶进行了比较,推测三神经元相互作用在生物系统中是可实现的。     

慢病毒介导的HBV-X基因可调控表达小鼠模型的构建

理想动物模型的缺乏是乙型肝炎病毒(HBV)研究的一个重要障碍.本实验运用可调控慢病毒载体结合精子介导的方法构建体内乙型肝炎病毒X基因(HBV-X)可调控表达的转基因小鼠模型.首先构建了四环素调控的HBV-X基因可调控表达慢病毒颗粒,再对雄性小鼠进行睾丸注射,后与母鼠合笼,母鼠分娩获得子代小鼠,最后利用Southern blot,反向PCR,Western blot以及免疫组织化学等方法分别对子代小鼠体内病毒基因整合情况和可控诱导表达情况进行检测.结果提示子代小鼠体内成功整合HBV-X基因,并在强力霉素(Dox)诱导后,可表达目的蛋白,可调控转基因小鼠构建基本成功.     

小鼠脂多糖应答蛋白mlrpS的载体构建及融合蛋白表达

为构建小鼠mlrpS-cDNA基因原核、真核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白。采用反转录-聚合酶链反应从经脂多糖刺激的鼠NIH3T3细胞cDNA中,扩增出编码mlrpS的cDNA。用限制性内切酶KpnⅠand XhoⅠ消化后,插入原核表达载体pTAT中,经酶切鉴定与测序证实后,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。异丙基β—D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生融合蛋白。经KpnⅠ和XhoⅠ酶切回收mlrpS-cDNA,插入pcDNA3．1载体中;pcDNA3．1-mlrpS再经KpnⅠ和ApaⅠ酶切后,插入到pEGFP—c1载体上,构建pEGFP-mlrpS融合的真核表达载体。构建mlrpS表达载体经测序证实,与GenBank登录的序列完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pEGFP及pTAT;SDS—PAGE证实融合蛋白表达成功。说明：成功地构建了mlrpS原核、真核表达载体,成功正确表达了6His／mlrpS融合蛋白。     

Cyclin E分子siRNA慢病毒载体的构建及其对骨肉瘤细胞系sosp9607的影响

设计筛选针对人cyclin E分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对骨肉瘤细胞系Sosp9607胞内cyclin E分子表达水平的影响.首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与cyclin E分子真核表达载体共同转染293T细胞.挑选出最有效抑制cyclin E表达的序列,应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因cyclin E的siRNA慢病毒载体pLKO-CE.使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收获病毒上清,感染Sosp9607细胞系,对病毒感染后抑制cyclinE表达的效果进行检测.结果在4条针对cyclin E分子设计的siRNA序列中,siRNA-464最为有效的抑制了外源性cyclin E分子的表达;带有该序列的慢病毒载体pLKO-CE可以完全抑制Sosp9607细胞中天然分子的表达,引起Sosp9607细胞生物学行为的改变:G1期细胞增多,S期减少,细胞增殖受抑制.说明应用基因工程技术成功构建了针对cyclin E分子的RNA干扰慢病毒载体,可有效抑制骨肉瘤细胞cyclin E的表达,使肿瘤细胞增殖减缓,为深入研究针对cyclin E的基因治疗方案的临床前实验研究提供了实验证据和理论依据.     

携人源TPA基因的慢病毒表达质粒的构建与鉴定

利用PCR扩增人源TPA基因,再用酶切-连接的方法将目的片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-PGK-eGFP中,最后用测序、酶切和在293细胞中瞬时表达的方法进行了鉴定.结果显示：含人源TPA基因的pL-PGK-TPA-eGFP慢病毒表达载体构建成功,为进一步利用转基因技术更加安全高效地生产TPA,治疗血栓类疾病打下基础.     

含PGK启动子慢病毒表达质粒的构建与鉴定

为了构建一个含有人源PGK1(human phosphoglycerate kinase 1)启动子的慢病毒表达载体 pL-PGK-GFP.采用PCR从人组织中扩增PGK1基因的启动子部分,再用酶切-连接的方法将扩增的启动子区片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-EGFP中,再用测序、酶切和瞬时表达的方法进行鉴定.结果是下游的eGFP基因在PGK1启动子驱动下,在293FT细胞中表达绿色荧光蛋白报告基因,这表明成功构建了慢病毒表达质粒pL-PGK-GFP.扩增的537bp PGK1启动子片段具有一定的启动效率,能在HIV来源的慢病毒载体中驱动下游目的基因的表达.     

慢病毒载体转染犬睾丸生殖细胞

摘要: 目的观察慢病毒载体( Lentiviral vector,LV) 对犬生殖细胞的转染,为基于LV 的精子介导法制备转基因动物提供依据。方法采用睾丸打点注射法,向比格犬两侧睾丸分别注入滴度为5 × 108、1 × 108、2 × 107 TU /mL 的慢病毒液组成3 个剂量组,每点注射量为每只犬0. 2 mL。于注射后第2 周开始采集精液,通过精液DNA 的PCR 检测和精子荧光镜检评估绿色荧光蛋白( green fluorescent protein,GFP) 基因的整合及表达。结果1) 在高剂量组,整合并表达GFP 基因的精子于第4 周首现并持续至第17 周; 在中、低剂量组于第5 周首现,分别持续到第14 周、12周。2) GFP 表达的高峰期在注射后第7 周～ 10 周。3) GFP 表达于整个精子,以顶体后区和精子尾颈部表达最强。4) 注射后第2 周～ 6 周,中剂量组犬采精困难,高低剂量组犬精子畸形率有上升的趋势。5) 在GFP 表达的高峰期,绿色荧光精子的百分率在高、中、低剂量组分别为43. 33% 、35. 53% 和4. 55% ,具有明显的差异。结论基于LV 的精子介导转基因法( Sperm-mediated gene transfer,SMGT) 可成功获得转基因犬精子,转基因阳性率、表达的强度与持续时间与慢病毒滴度相关。     

帕金森患者行走能力评估系统

该系统可应用于柔性阵列压力传感器搭建的S型步态通道平台,采集帕金森患者动态足底压力分布数据,并通过以太网传输至PC机进行分析。对患者足底压力数据依次进行数据去噪、聚类分割、脚型识别、参数提取等处理,获取患者详细的步态时空参数,运用模糊分类方法对数据进行分类评估。实验结果表明：该分类方法具有较高的分类准确率（93％）,该系统能够有效地实现帕金森患者行走能力的评估。     

快速老化小鼠SAM-P/8出现类帕金森病现象初探

目的探讨快速老化小鼠SAM-P/8的同向旋转现象与帕金森病动物模型的相关性。方法取发作旋转行为的7月龄雄性SAM-P/8和同源对照SAM-R/1小鼠各6只,分为旋转组和正常对照组两组,首先采用老化度评价标准对其老化度进行评定,其次根据帕金森病动物模型造模标准对其旋转行为进行评定。结果同月龄SAM-P/8的老化度高于SAM-R/1;SAM-P/8出现可重复的同向右侧旋转,频率为60 r/min,符合帕金森病动物模型造模成功的标准,SAM-R/1无旋转现象出现。结论初步认定SAM-P/8的同向旋转现象为类帕金森病现象,对帕金森病研究有重要意义。     

帕金森病食蟹猴系统性模型构建与在体临床过程的动态评价研究

目的 应用行为学与分子影像学的方法在体动态评价帕金森病食蟹猴系统性模型的临床变化特征,为药物、干细胞等治疗的临床前研究提供稳定有效的PD灵长类动物模型。方法 7只10～15岁的健康食蟹猴连续静脉注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)0.2 mg/kg体质量,诱导系统性PD模型,持续观察PD症状进展3个月,随后给予左旋多巴干预。应用PD评分量表评价动物的临床症状严重程度,用EthoVision动物运动轨迹跟踪系统分析随意运动距离、运动轨迹的变化,用正电子发射断层显像技术(Positron emission tomography,PET)分子显像剂18F-AV-133评估纹状体多巴胺能神经元的功能状态。结果 所有动物在给予MPTP注射14 d后出现了典型的包括震颤、肌僵直、运动迟缓等PD症状,1个月临床评分达到峰值(21.43±5.35)。随后PD症状趋于稳定,连续观察至2个月(18.43±3.87)、3个月(18.14±3.53),与MPTP注射结束时(14.43±1.90)相比,临床评分均显著升高(P<0.05)。在3个月随意运动距离(809.77±401.15)cm较基线(8627.46±5751.04)cm显著降低(P<0.01)。18F-AV-133双侧纹状体平均特异性摄取率(Sur)在3个月时(0.16±0.03)较基线(1.66±0.58)显著降低(P<0.01)。在给予L-Dopa干预后可见PD症状显著改善,临床评分(12.86±3.63)较之模型期显著降低(P<0.05),而随意运动距离则显著增加(P<0.05)。结论 本研究构建的PD食蟹猴系统性模型临床症状持续稳定,纹状体多巴胺能神经损害,对L-Dopa干预有效,全程无自发性恢复,更近似地在体动态模拟了PD的临床特征,以期为PD未来研究提供实验依据。     

不同生理条件下步态数据的复杂性测度分析

目的研究步态从一个侧面反映出的人体健康状况和病态特征,突破步态数据具有高维性、非线性、不便于定量分析的难题。方法将非线性动力学复杂性测度引入步态数据的分析。结果步态的复杂度与年龄等生理状况密切相关。结论通过数据长度对分析结果的影响,表明复杂度具有模型独立和计算简单等特点,它在步态分析中应用的前景较为乐观。     

小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量.     

卷积神经网络在MRl图像诊断中的应用

基于卷积神经网络对颅内组织器官疾病诊断提出了创新思路.选取帕金森病患者图像通过灰度映射、直方图均衡化、改进的小波去噪、图像增强等预处理,以VGG-Net网络模型为基础设计并搭建卷积神经网络,采取正则化策略避免过拟合问题,用患者MRI图像集对网络模型进行5次十折交叉验证,同时通过反卷积网络实现特征可视化,挖掘疾病潜在特征.实验结果和客观评价表明,本文搭建的网络可根据患者MRI图像实现良好的辅助诊断.     

原核表达载体pHsaE1αβ的构建和人丙酮酸脱氢酶的表达与纯化

以质粒pQE9为原型载体, 将编码hPDH的α和β亚基的cDNA串联克隆到该载体上, 成功地构建了hPDH基因的表达载体pHsaE1αβ. 并在大肠杆菌中表达了hPDH, 通过亲和层析法进行纯化, 对一些生物化学性质进行表征.