发酵过程中小单孢菌40027及其衍生菌株的抑菌作用

研究了不同遗传背景下福堤霉素A的产生菌——小单孢菌40027菌株及整合了质粒pSET152菌株的抑菌作用.以金黄色葡萄球菌为指示菌跟踪不同时期小单孢菌40027菌株和Micromonospora sp. 40027::pSET152菌株的抑制活性.结果表明:小单孢菌40027菌株抑菌活性比Micromonospora sp .40027::pSET152的抑菌活性强;小单孢菌40027菌株和Micromonospora sp. 40027::pSET152菌株分别在种子液制备第1 d及第2 d时菌种产素能力较大.小单孢菌40027菌株和Micromonospora sp. 40027::pSET152菌株在发酵液制备第4 d为最佳产素时间.分别采用超声波法和反复冻融法破碎菌丝体,结果表明超声波破碎法较为理想,为进一步研究小单孢菌胞内产素情况打下了基础.     

150株小单孢菌的分类及生物活性

对从承德地区土样中分离出来的150株放线菌进行了初步的分类研究,初步鉴定为小单孢菌属菌株.从中选出100株与3株小单孢菌属(Micromonospora)已知菌株进行生物活性的测定.通过测定发酵液的化学效价,筛选出2株庆大霉素效价高的野生型菌株,其中菌株80221的化学效价为983.58 mg/L,菌株80177的化学效价为1 076.88 mg/L.     

邻氯硝基苯降解菌OCNB-1的分离鉴定与降解质粒

以邻氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源,从某化工厂废水处理站活性污泥中分离出一株细菌OCNB-1, 经微生物自动测定仪WSVTK-R07.02和16S rDNA扩增测序初步鉴定为Pseudomonas putida;在培养基pH值为8.0、培养温度为32 ℃、摇床转速为120 r/min的条件下,考察了该菌株降解邻氯硝基苯的能力,发现菌株42 h内将起始浓度为1.07 mmol/L的该化合物降解了约80%;经质粒检测,在OCNB-1菌株中发现一条质粒条带,选用7种内切酶对质粒pOCNB-1进行单酶切,得出质粒大小约为32 kbp;抗生素抗性实验表明菌株对红霉素、氨苄青霉素、青霉素钠的抗性与质粒无关,对利福平、氯霉素的抗性与质粒有关;通过细菌接合,质粒转移到无降解邻氯硝基苯能力的Pseudomonas.stutzeri受体菌中,接合子Pseudomonas.stutzeri能利用邻氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源,证明质粒为降解质粒.     

周口地区凤仙花白粉寄生孢的分离及鉴定

从河南省周口市采集感染白粉病的凤仙花植株,对其进行白粉寄生孢的分离和鉴定.采用单孢分离法分离得到1个单菌系,对该单菌系进行菌落和显微形态分析,初步证明该菌株为Ampelomyces quisqualis.利用真菌通用引物ITS1和ITS4对所分离的单菌系内转录间隔区(inter transcribed spacer,ITS)进行PCR扩增,得到578bp大小的片段,经过克隆测序和在GenBank中进行BLASTn分析,发现与德国和美国白粉寄生孢ITS序列的同源性达到100%,进一步证明该分离菌株为A.quisqualis.     

寡核苷酸介导的重组工程法构建容纳毒性基因ccdB的新型菌株

毒性基因ccd B是最为常用的一种负筛选标记,ccd B基因和R6K复制子一起组成了高效的基因克隆和基因组修饰的遗传操作元件.为获得高转化效率的容纳ccd B基因的菌株,本研究采用重组工程手段,以经优化去除了错配修复的寡核苷酸与p UC骨架、含有ccd B基因的质粒p MK2010共转化,直接对含pir116基因型的大肠杆菌DH10B衍生菌株的基因组进行修饰.在筛选的10个菌株中,7个为预期的Gyr A462基因型.为消除p MK2010,构建了一个p UC骨架、氨苄青霉素抗性的诱导自剪切质粒p LS2750.p LS2750通过质粒不相容性去除p MK2010后,经诱导I-Sce I自剪切而消除.所得菌株LS027的电转化效率为6.9×10~8/mg,是对照菌株的约100倍,R6K质粒呈现高拷贝.以LS027为宿主菌的构建了系列克隆载体,以只进行基因克隆可避免载体自连的干扰.新型ccd B基因容纳菌株LS027有着基因操作方面广泛运用的潜力.     

越南伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记及功能稳定性

利用氨基纳米黏土介导的转化方法，应用红色荧光蛋白DsRed标记生防细菌越南伯克霍尔德氏菌Burkholderia vietnamiensis B418并研究标记菌株的功能稳定性。将带有DsRed基因的重组质粒pGEX-4T-1-DsRed转化导入B418菌株中，采用细菌培养法、继代培养法和平板对峙培养法检测标记菌株的功能稳定性。通过氨基纳米黏土转化体系成功获得了荧光标记菌株B418-DsRed,与野生菌株B418相比，其生长曲线和形态学特征基本一致。继代培养10代后，标记菌株在共聚焦显微镜下呈现亮红色荧光，能够提取到外源质粒pGEX-4T-1-DsRed,并通过聚合酶链式反应扩增获得荧光基因序列DsRed,证明标记菌株具有较好的遗传稳定性。平板对峙培养试验显示，标记菌株B418-DsRed对尖孢镰孢菌和大丽轮枝菌抑制率分别为55.25%和67.55%,与野生菌株B418无显著性差异，表明外源质粒的导入未影响菌株的抑菌能力。以上结果表明通过氨基纳米黏土介导成功实现了伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记，构建的标记菌株B418-DsRed可用于该生防菌在植物根际的定殖及与病原菌的互作研...     

一株主产庆大霉素C2a工程菌的构建

为更好生产单组分庆大霉素C2a,拟构建一株主产庆大霉素C2a的工程菌.通过序列比对分析,锁定genB2为构建该工程菌的关键基因.以绛红小单孢菌G1008基因组为模板,PCR扩增genB2的上下游序列为同源交换臂,构建同源重组质粒pZB303.通过接合转移,将质粒pZB303导入绛红小单孢菌G1008,安普抗性及PCR扩增筛选得到一株genB2框内缺失工程菌GB102.发酵并提取代谢产物,再经TLC,HPLC,MS分析.结果表明,工程菌GB102主要积累庆大霉素C2a.有望用于生产单组分庆大霉素C2a.     

含小单孢菌有机肥料肥效试验研究

为验证含小单孢菌有机肥料在青菜生产上的肥效,在华北平原平行异地两处进行实验.供试作物为青菜(品种上海青);供试有机肥料为小单孢菌有机肥料,其营养成分有机质≥45%、有效养分(N+P2O5+K2O)≥5%.常规施肥为667 m2底施复合肥50 kg,加尿素15 kg.试验采用配对设计的方法,设两个处理,4次重复,小区面积20 m2.试验组为常规施肥加667 m2底施小单孢菌有机肥料20 kg;对照组为常规施肥.结果表明,小单孢菌有机肥料能提高青菜的株高、单株叶片数和单株重.露地平均每667 m2增产73.7 kg,增产5.3%,产量差异达到显著水平;大棚平均每667 m2增产300 kg,增产10.1%,统计分析产量差异达到极显著水平.     

邻氯硝基苯降解菌Pseudomonas putida OCNB-1的分离、鉴定与降解质粒研究

摘要：以邻氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源从某化工厂废水处理站分离出一株细菌, 经微生物自动测定仪WSVTK-R07.02和16SrRNA扩增测序鉴定为Pseudomonas putida;在 培养基pH为8.0,培养温度32 ℃,摇床转速120 rpm 条件下考察了该菌株降解邻氯硝基苯的能力, 菌株42 h内将起始浓度为1.07 mM的对邻氯硝基苯降解近80%;经质粒检测,在菌株OCNB-1中发现一条质粒条带,选用7种内切酶对质粒pOCNB-1进行单酶切,得出质粒大小约为32 Kb;抗生素抗性实验表明菌株对红霉素、氨苄青霉素、青霉素钠的抗性与质粒无关,对利福平、氯霉素的抗性与质粒有关;通过细菌接合,质粒转移到无降解邻氯硝基苯能力的Pseudomonas.stutzeri受体菌中,接合子Pseudomonas.stutzeri能利用邻氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源,证明质粒为降解质粒。     

同工异源酶基因forp与genp异源表达的研究

来自绛红色小单孢菌G1008的genp与来自橄榄星小单孢菌FOM808的forp,均参与3’,4’-双脱羟基,2个基因属于同工异源酶基因.应用同源重组原理,实现forp替换genp,探索同工异源酶基因异源表达的可能性.以温敏型穿梭质粒pKC1139为载体,构建同源重组质粒pFP4.经接合转移将载体导入到G1008基因组中,利用影印筛选和PCR验证的方法,获得基因重组工程菌FTP2.提取工程菌次级代谢产物,经TLC和MS分析.结果表明,工程菌仍然可以产生庆大霉素C组分.forp基因的功能得到了体现,外源基因forp实现了异源表达,进一步证实forp是负责参与3’,4’-双脱羟基的功能基因.     

萘对铜绿微囊藻和聚球藻生长及叶绿素荧光影响的比较

为探究萘对不同粒径蓝藻的胁迫效应,采用5组不同质量浓度萘(0、0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L)分别对聚球藻(Synechococcus sp.)和铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa,PCC7806)进行为期7 d的处理,分析不同浓度萘处理下,藻细胞浓度、叶绿素a含量及叶绿素荧光参数的变化,探究不同浓度萘处理对2种藻的生长及生理影响。结果表明:(a)整个处理周期内,聚球藻的生长被显著抑制,其叶绿素a含量减小了3.9%~40.4%;(b)聚球藻的潜在光合作用能力、光合作用速率均有所减弱,但其耐受强光的能力有所增强,说明聚球藻对萘具有较强的敏感性;(c)萘对铜绿微囊藻生长具有显著的促进作用,增强了其潜在光合作用能力,但抑制了其细胞内叶绿素a的合成。     

广西䗛目3新种记述

记述采自广西的Ｙｏｕ目昆虫３新种,即Ｙｏｕ科的兴安短肛Ｙｏｕ（Ｂａｃｕｌｕｍｘｉｎｇａｎｅｎｓｅｓｐ．ｎｏｖ．）异Ｙｏｕ科的广西原异Ｙｏｕ（Ｐｒｏｓｃｅｌｅｓｇｕａｎｇｘｉｅｎｓｉｓｓｐ．ｎｏｖ）和蓝胸蔷Ｙｏｕ（Ａｓｃｌｅｓｃａｅｃｉｕｓｓｐ．ｎｏｖ．）对其形态进行了描述,与近缘种作比较,并附特征图。     

促进种子萌发的重楼内生菌的筛选

通过比较60株重楼内生细菌发酵液的水相提取液和有机相提取液对冬小麦种子萌发的影响,发现8株细菌的有机相提取物具有促萌发作用.将其中4株细菌的发酵液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,蒸干物用甲醇溶解并稀释成不同浓度处理冬小麦种子.结果表明:肠杆菌属74#菌的石油醚相提取物、不动杆菌属108#菌的氯仿相提取物、芽孢杆菌属138#菌的氯仿相提取物和克雷白氏杆菌属149#菌的乙酸乙酯相提取物的促萌作用较强(p0.05);其中芽孢杆菌属138#菌的氯仿相提取物的1/2稀释液的促萌作用最强(p0.01).     

低温菌穿梭质粒的构建及转化方法研究

 由于低温微生物在细胞结构上的特殊性,使得对它们进行遗传操作受到很大的限制.以分离自冻土的低温菌Acinetobacter sp.DWC6为宿主菌,构建了一套外源DNA导入系统.通过在质粒pBR322和pUC118中插入一段Acinetobacter属特异性的Ori片段,成功构建了一系列穿梭质粒,并建立了稳定的转化方法,所有重组质粒均可在Escherichia coli和Acinetobacter sp.DWC6中正常复制.通过优化转化方法,使质粒在低温菌Acinetobacter sp.DWC6中的转化率达3×10⁶转化子/μg DNA.     

鱼油与微藻和植物油脂肪酸成分比较及其替代策略分析

【目的】水产养殖业的快速发展和鱼油价格的快速上涨,使得寻找能够替代鱼油的脂肪源日趋紧迫。【方法】采用直接转酯化进行气相色谱鉴定的方法测定鱼油、多种常见植物油和两种微藻的脂肪酸组成,以37种脂肪酸标准品作为参照,比较分析3类脂肪源的异同。【结果】鱼油的脂肪酸组成与微绿球藻(Nannochloropsis sp.)和裂壶藻(Schizochytriumsp.)相似,但植物油与鱼油相比缺乏EPA和DHA等n?3高不饱和脂肪酸。在满足必需脂肪酸需求的前提下,提出两种替代鱼油的策略:1使用38.0%亚麻籽油配合27.7%微绿球藻藻油和34.3%裂壶藻藻油替代鱼油的策略获得与鱼油一致的n?3/n?6多不饱和脂肪酸比率,能够较好地满足鱼类的营养需求,可作为替代鱼油的首选策略;2使用38.0%大豆油配合27.7%微绿球藻藻油和34.3%裂壶藻藻油替代鱼油的策略则获得与鱼油大体相同的主要脂肪酸类别,价格较亚麻籽油组低廉,可作为备选策略。【结论】使用高EPA和DHA含量的微藻藻油配合植物油替代鱼油在理论上是可行的。     

产丁醇大肠杆菌工程菌的构建

【目的】为了在大肠杆菌(Escherichia coli)中导入改良的丁醇合成途径,使非生产菌株大肠杆菌具备产丁醇的能力。【方法】克隆大肠杆菌乙酰转移酶基因atoB和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)丁醇合成途径关键酶基因(crt、hbd、adhE),构建多顺反子表达质粒pSE380-atoB-adhE-crt-hbd;克隆齿垢密螺旋体(Treponema denticola)反式烯酰辅酶A还原酶基因ter,构建表达质粒pSTV29-ter,并将双质粒导入到大肠杆菌。【结果】构建的工程菌能半厌氧发酵产微量丁醇,产量为0.08g/L。【结论】大肠杆菌中的丁醇合成途径导入成功,构建了产丁醇的大肠杆菌工程菌。     

Efficient transformation and expression of gfp gene in the edible mushroom Pleurotus nebrodensis

An efficient transformation method mediated by PEG-protoplasts was developed for the newly commercial edible mushroom Pleurotus nebrodensis. Two plasmids were used to co-transform protoplasts of P. nebrodensis. One plasmid is pAN7-1 containing a positive selectable marker gene hph conferring hygromycin B resistance. Another plasmid is pBlue-GFP containing a reporter gene gfp conferring green fluorescent protein. PCR and Southern blot analysis showed that hph gene or/and gfp gene were integrated into the genome of P. nebrodensis transformants. The transformation efficiency of the positive selectable marker gene hph was 3 transformants per microgram of plasmid pAN7-1 DNA, which was about 30 times higher than that previously reported in thoroughly studied Pleurotus species such as Pleurotus ostreatus. The transformation efficiency of the reporter gene gfp was 9 transformants per microgram of plasmid pBlu-GFP DNA. The co-transformation efficiency was 23.68%. This is the first report that a ＂reporter＂ gene, green fluorescent protein gene can be successfully stably exoressed in this Pleurotus species.     

Transformation of ginkgo hairy root and establishment of its suspension culture clone

Tender leaves, buds and stems ofginkgo biloba L. were transformed successfully byAgrobacterium rhizogenes with Ri plasmid, and its suspension cultured clone was eastablished. The result of detection of opines suggested thatA. rhizogenes had integrated the T-DNA of the Ri plasmid into genomic DNA of ginkgo cells. A new way is offered to exploit ginkgo resources with biological technology. Liu Shunan: born in 1972, Postgraduate     

海绵Pseudoceratina sp.共栖细菌多样性及其抑制甘蔗鞭黑粉菌活性研究

【目的】探讨广西斜阳岛附近海域海绵共附生细菌的多样性,并筛选对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的活性物质,为发现潜在的细菌新物种及开发农用生防菌肥奠定基础。【方法】采用稀释涂布法,通过6种复合营养分离培养基,从海绵Pseudoceratina sp.中分离可培养的共附生细菌。采取细菌形态学观察去除冗余,通过PCR扩增菌株的16SrRNA基因序列,并通过构建系统发育树分析物种多样性。采用牛津杯法进行抑制甘蔗鞭黑粉菌活性筛选实验。【结果】从海绵Pseudoceratina sp.中共分离到可培养细菌54株,经16SrRNA基因序列对比后,获得24株细菌,隶属于13科14属。其中,菌株BGMRC 2118与已发表有效菌株的16SrRNA基因序列的最高相似率为96.46%,可能为潜在新种。抑菌筛选实验结果显示,有8株细菌的发酵粗提物对甘蔗鞭黑粉菌具有很强的抑菌活性。【结论】广西斜阳岛附近海域中海绵共附生细菌具有较高的物种多样性,蕴藏着丰富的新物种资源,富含生物活性菌株。