枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化方法的研究

【目的】研究比较枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化的最优方法。【方法】以质粒pHCMC04(大小为8089bp)转化突变型枯草芽孢杆菌IA857,分别用电转化法、原生质体法、电击法诱导的原生质体法、Spizizen低盐环境感受态转化法(简称S法)、低盐环境形成饥饿感受态法及其改良方案在其它突变菌株的试验方法(简称C法)进行实验,通过比较优化得出最优转化方法。【结果】采用S法转化枯草芽孢杆菌突变株IA857,质粒加入量为70ng时,转化后直接摇床培养1h转化率最高达到1.2×104 CFU/μg DNA,可以满足枯草芽孢杆菌高效转化的要求。【结论】得出了枯草芽孢杆菌突变株IA857最优转化方法并提出转化枯草芽孢杆菌的基本框架。     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

短小芽孢杆菌遗传操作系统的建立及应用

短小芽孢杆菌SCU11产生的胞外碱性蛋白酶具有良好的生皮脱毛效果,在生物制革领域有很大的应用前景.但该菌株的遗传转化系统尚未建立起来,限制了菌株的遗传改造和基因功能研究等方面的工作.本研究采用高渗透压电转化法,实现了对短小芽孢杆菌的电转化;在Ebuffer配方为甘露醇1M,山梨醇0.5M,甜菜碱7.5%,甘油10%,电场强度24KV/cm条件下,转化效率为3.5×10~3 CFU/μg DNA.构建了E.coli-Bacillus穿梭载体pUCETs,建立了短小芽孢杆菌基因敲除体系,利用该系统成功敲除了基因组中的peptidaseC40基因.本研究所建立的电转化系统及基因导入/敲除体系,为短小芽孢杆菌基因组编辑奠定了基础.     

一种适合芽孢杆菌质粒DNA提取的改良碱裂解法

以Birnboim和Doly的质粒提取方法为基础,通过缩短菌体培养时间,增加菌体收集量,并对提取过程中所用的三种主要溶液的用量进行适当调整等,摸索出质粒提取的一种改良碱法.用改良后的碱法对浸麻芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌进行质粒提取,均获成功.     

根癌农杆菌电击转化条件的研究

探索了根癌农杆菌EHA105的高效转化方法.将双元载体质粒pBIN19/glgB经电击转化法导入根癌农杆菌EHA105,研究不同实验条件对转化率的影响.结果表明:在细胞浓度OD600为1.0时进行电转化,转化率最高,达到每微克DNA1.12×105CFU;当电场强度为11 kv/cm,转化率最高,达到每微克DNA1.78×105CFU;在一定的细胞浓度范围内,电击转化率与细胞浓度密切相关,转化率随着细胞浓度的上升而上升;质粒大小能影响电击转化率,转化率随着质粒的增大而下降.应用该优化的电击转化条件将双元载体质粒pBIN19/glgB成功导入根癌农杆菌EHA105,构建了植物双元表达载体.     

壳聚糖对益生菌生长的影响及其机理——以地衣芽孢杆菌为例

壳聚糖对细菌的影响是当前壳聚糖应用研究的热点问题。选择益生菌地衣芽孢杆菌为研究对象，采用控制变量法，实验观测不同浓度的壳聚糖对地衣芽孢杆菌生长的影响。结果表明，不同浓度的壳聚糖对于益生菌地衣芽孢杆菌生长既有抑制作用，也有促进作用。以O．50％壳聚糖浓度为限，浓度小于O．50％时表现为抑制作用，而浓度大于O．50％时表现为促进作用。     

深海抗锰细菌的分离鉴定

从太平洋深海底泥样品中富集、筛选得到50株锰抗性细菌, 16S rDNA鉴定结果表明这50株细菌中含有40株芽孢杆菌、3株短杆菌、1株短状杆菌、1株考克氏菌、4株副球菌和1株食烷菌.50株中80%是芽孢杆菌,有6个种.90%以上为革兰氏阳性菌.短小芽孢杆菌(B. pumilus)Mn12对Mn2 的耐受能力最好,最高的Mn2 耐受浓度是130 mmol/L.该菌在28℃以200 r/min培养24 h后,能去除含锰(Ⅱ)10 mmol/L培养基中90%的锰(Ⅱ)(锰含量由高碘酸盐分光光度法测定).而Mn59在同样条件下,可耐受30 mmol/L锰(Ⅱ),可去除99%的锰(Ⅱ),具有抗性高、去除率高、速度快的优点,具有极大的应用前景.     

水稻共生菌DX01的分子鉴定及电击转化条件的初步探索

用ＰＣＲ的方法扩增了水稻表面共生菌ＤＸ０１的１６Ｓ ｒＤＮＡ片段,并进行了部分序列的测定和ＢＬＡＳＴ同源序列比较分析,结果表明,该序列３’端５５０ｂｐ与短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）１６ Ｓ ｒＤＮＡ的同源性达９９％,５‘端６８０ｂｐ为９８％,故ＤＸ０１应为Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ。对其电击法转化的部分条件进行了初步的探索,结果表明：当细菌处于Ｄ（６００）为０．９的生长期时,使用ＰＥＢ     

田基黄提取物抑菌作用的研究

该实验以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青黄链霉菌、酿酒酵母菌、苏云金芽孢杆菌和变形杆菌为供试菌种,采用采用滤纸片扩散法对田基黄水提取液进行抑菌实验研究,并测定其最低抑菌浓度（MIC）,其结果表明：田基黄水提取物对供试菌种普遍有抑制作用,黑曲霉除外;MIC也因菌种不同而不同,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和青黄链霉菌为0.25g/mL,酿酒酵母菌为0.5g/mL,苏云金芽孢杆菌和变形杆菌均为0.125g/mL.实验还采用不同有机溶剂的提取物对选取的五种供试菌种进行抑菌作用研究,其结果表明：田基黄有机溶剂提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青黄链霉菌、苏云金芽孢杆菌均有抑制作用,且抑菌效果均比水提取物的抑菌效果明显.     

一种枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的颉颃作用研究

通过液态颉颃培养法和琼脂扩散法,研究枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌在不同浓度比例和时间维度上的颉颃作用,并确定最适宜的菌种用量。试验结果显示,枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌有明显的颉颃作用,且枯草芽孢杆菌浓度越高,颉颃作用越明显。液态培养法中枯草芽孢杆菌与副溶血弧菌比例为100:1时最为明显,4 h抑菌率可达100%;比例为1:1时24 h后抑菌率稳定保持在80%以上。琼脂扩散法结果显示当枯草芽孢杆菌与副溶血弧菌比例大于等于1时会产生明显的抑菌圈,且抑制作用稳定持久。基于对枯草芽孢杆菌添加成本的考虑得出,不同时段枯草芽孢杆菌最适使用浓度不同。4 h内投放枯草芽孢杆菌最适浓度比为50:1;8 h内投放最适浓度比为10:1;8 h后间歇性投放浓度比为1:1的枯草芽孢杆菌。     

甲醇酵母PEG和电转化法

~~甲醇酵母PEG和电转化法@李亚东$河北大学生命科学学院!河北保定071002 @王会文$河北大学生命科学学院!河北保定071002 @赵晓瑜$河北大学生命科学学院!河北保定071002~~~~~~     

硫氰酸铁铵-氯仿体系光度法测定聚乙二醇

利用聚乙二醇(PEG)存在下,Fe(SCN)3在水相和氯仿相之间进行分配,光度法间接测定聚乙二醇的浓度。不同分子量PEG氯仿相的最大吸收波长为515nm,振摇时间30min,不同聚合度PEG的线性回归方程、精密度、回收率等实验结果均满足实验要求,可用于实际工作。     

透明颤菌血红蛋白基因在苏云金杆菌中的表达

采用大肠杆菌与枯草杆菌的穿梭质粒pMK4作为载体,构建了含有果聚糖酶基因(sacB)启动子和vgb基因的重组质粒pMK-SV.通过原生质体和电转化,将pMK-SV转入苏云金杆菌中,经影印筛选得到转化子Bt4.对Bt4诱导表达,与原菌株相比Bt4的生长量增加了20.2%.     

一种直接用于PCR分析的风沙土微生物总DNA提取方法

以风沙土为材料,直接提取土壤微生物DNA.采用SDS—溶菌酶—CTAB—蛋白酶K和液氮反复冻融法裂解细胞得到DNA粗提液,以PEG对其纯化.结果表明,SDS—溶菌酶—CTAB—蛋白酶K和液氮反复冻融法裂解细胞可获得大片段的DNA,提高DNA产率.每克干土的DNA提取量为0.586～1.311μg.所提DNA片段在23Kb以上.PEG可有助于去除DNA中腐植酸,DNA不作回收纯化即可作为模板进行16SrDNAPCR扩增.SDS—溶菌酶—CTAB—蛋白酶K和液氮反复冻融裂解细胞、PEG纯化DNA的方法组合是一种简便的适合风沙土微生物总DNA的提取方法.     

氧化石墨纳米薄片表面接枝聚乙二醇

利用甲苯二异氰酸酯(TDI)作为连接剂,将聚乙二醇接枝在氧化石墨纳米薄片(GONPs)表面。氧化石墨选用改良的Hummers方法制备,并用过量的TDI进行化学改性。经过改性后的氧化石墨在无水二甲基甲酰胺中剥离形成氧化石墨纳米薄片,随后在氮气保护下接枝上聚乙二醇。用X-射线衍射、傅里叶红外及元素分析对产物进行研究表征。     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

PGPR芽孢杆菌B-1菌株的鉴定及其应用效果

从国外产品中分离得到一株PGPR菌株,编号为B-1;观察了该茵株的形态大小和茵落形态,进行了生理生化反应,通过热变性法测定其G+C(鸟嘌呤-胞嘧啶)摩尔分数为47.2%,鉴定该菌株为短芽孢杆菌(Bacillus brevis);通过小麦水培实验研究了该菌株对小麦株高和鲜重的影响,地上部鲜重较对照增加10.64%,株高较...     

拮抗烟草青枯病菌的烟草内生细菌系统多样性及趋化性分析

 从来自3个烤烟品种NC297、红大、K326的600株内生细菌中,以烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)为靶标,共筛出55株拮抗菌,其对烟草青枯病菌的抑菌圈直径在1~16 mm之间.对这55株拮抗性内生细菌的16S rRNA基因序列进行RFLP分析共产生6种带型.根据RFLP带型选取16株进行16S rRNA基因序列测定和系统发育分析.结果表明这55株拮抗性内生细菌属于Firmicutes和Proteobacteria两大类群的6个种:Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum,Bacillus methylotrophicus,Bacillus tequilensis,Brevibacillus parabrevis,Brevibacillus brevis和Pseudomonas aeruginosa.利用cheA基因检测方法和平板检测方法共筛选到3种具有趋化性的拮抗性内生细菌:Brevibacillus parabrevis,Brevibacillus brevis和Pseudomonas aeruginosa.     

Effect of addition of poly（ethylene glycol） on electrical conductivity of poly（3,4-ethylenedioxythiophene）-poly（styrenesulfonate） hybrid

By mixing various concentrations of poly (ethylene glycol), a series of poly(3,4-ethylenedioxythiophene)-poly(styeenesuffonate) composite thin films were prepared.The electrical conductivity of the PEDOT-PSS/PEG thin films was measured by the four-pcobe method. Experimental results showed that the inclusion of poly(ethylene glycol) influenced the electrical conductivity of PEDOT-PSS film significantly. With the increase of PEG concentrations, the electrical conductivity sharply increased to reach a maximum and then slowly decreased down. Furthermore, the PEG molecular weight and environment temperature also played important roles on the electrical conductivity of PEDOT-PSS/PEG thin films. A good linear relationship was found between in σDC and T^-1/2 within the entire temperature range detected.