甲醇营养型酵母表达系统及其应用进展

甲醇酵母表达系统是一种广泛使用的真核表达系统，它具有表达量高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点。本文综述了甲醇酵母表达系统的特点、提高重组蛋白表达量的方法及近年来甲醇酵母表达系统在病原微生物及抗体工程中的一些研究应用状况。     

丝状真菌表达系统在thaumatin基因工程中的优化

在thaumatin重组生产中，丝状真菌是最成功的表达系统，十几年来，为了最大程度地获得重组thaumatin，人们对丝状真菌表达系统进行了各种优化，如选用特异性强启动子、增加基因拷贝数、利用蛋白酶缺陷株、进行基因融合、优化反应条件等。随着丝状真菌表达系统的优化，重组thaumatin的产量也随之提高。     

粗集理论及其应用（三）──知识表达系统

知识表达在智能数据处理中占有十分重要的地位。本文主要讨论知识处理框架中的知识表达方法，首先介绍用数据表描述的知识表达系统及形式化定义，然后给出知识表达系统中属性的重要性概念。在文中我们还根据粗集理论讨论了决策理论中的一些基本问题和决策表简化的方法，介绍决策表的形式化定义和一些性质。     

人工合成人表皮生长因子在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中高产表达人表皮生长因子（hEGF），并探索提高外源基因在pET-3c：BL（DE3）表达系统的表达水平的途径。方法：根据大肠杆菌对密码的偏爱性，合成编码53个氨基酸的hEGF基因，分别以非融合蛋白和融合蛋白两种方式表达。计算机两者mRNA的翻译起始区（translation initiation region，TIR）的结构。结果：融合蛋白表达产量为27％，非融合蛋白的表达用SDS－PAGE检测不到，两者均具有促细胞增殖的活性。融合蛋白mRNA的TIR的△G值较非融合蛋白的高。结论：在pET－3c：BL21（DE3）大肠杆菌表达系统中，以融合蛋白方式表达人表皮生长因子，表达效率高且不影响其活性，此外，mRNA的TIR的结构可能是影响外源基因在本研究的表达系统的表达效率的一个重要因素。     

甘蓝型油菜瞬时表达系统研究

本文利用PEG介导外源基因转化甘蓝型油菜叶肉原生质体，以花椰菜花叶病毒35S启动子启动荧光素酶基因作为瞬时表达实验的报告基因，对PEG转化液配方、渗透压稳定剂、转化供受体配比等转化过程中的关键影响因素进行考察优化，建立起稳定高效的油菜瞬时表达系统.     

neuritin基因杆状病毒表达载体的构建

为研究Neuritin蛋白的功能,将neuritinORF在杆状病毒-昆虫表达系统中表达,构建杆状病毒表达载体.以308D10为模板,利用PCR方法扩增neuritinORF,定向克隆法将其克隆至PFASTBAC-HTA转移载体中.然后利用同源重组原理将其转移至杆粒bacmid中.得到携带neuritin ORF的重组杆粒.本实验获得了重组目的基因真核表达载体并经PCR鉴定,插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符,成功构建了Neuritin的杆状病毒表达载体.     

基于规范知识的桥梁智能CAD系统

桥梁智能CAD是计算机技术与桥梁设计知识高度综合的结果。规范知识的表达和推理是CAD系统的一个重要部分。在桥梁CAD系统中规范知识表达和应用将直接影响知识存储，推理机制和用户的接口形式。     

利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPVl6E6蛋白

目的 利用昆虫一杆状病毒表达系统高效表达HPVl6E6蛋白.方法 将HPVl6E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTB),然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的 基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,westem-b10t分析鉴定表达蛋白.结果 SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白.结论 利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达.     

增加外源基因在植物中复制、转录和翻译的策略

与其他的真核表达系统(例如酵母和昆虫)比较,植物表达系统的主要优越性在于植物细胞具有全能性,能再生植株.这是植物表达系统能够以低廉的成本大规模生产重组蛋白的潜力.但是,由于植物表达系统重组蛋白表达产量低,使植物表达系统在大规模重组蛋白生产中的应用受到很大的影响.蛋白的产量与基因的数量、基凶的转录和翻译水平密切相关.近年来,人们在增加外源基因在植物中复制、转录和翻译作了大量的探讨,使在植物表达重组蛋白产量低的问题得到改善.笔者综述了这方面的研究进展.     

人胰岛素基因重组杆状病毒在家蝇中表达的研究

目的利用杆状病毒表达系统进行人胰岛素基因在家蝇中表达的研究.方法用携带有人胰岛素基因的重组杆状病毒感染家蝇幼虫,用放射免疫技术、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对蝇蛆胰岛素表达水平进行检测.结果重组的杆状病毒感染家蝇幼虫后,蝇蛆中有人胰岛素的表达,表达量为37.401μIU/mL,占蝇蛆总蛋白的0.583%.结论利用杆状病毒表达系统可以在家蝇蝇蛆中表达人胰岛素.     

基于PiggyBac转座系统的低溢漏诱导型Tet-On过表达体系的建立及应用

为避免诱导基因稳定表达的Tet-On诱导表达系统溢漏表达,实现简便且高效的外源基因稳定诱导表达, 本研究拟在Tet-On调控的转录水平基础上,将基于稳定配体Shield-1的不稳定结构域FK506结合蛋白引入目的基因的N端,从蛋白水平控制其本底表达水平.为验证该系统的效果,本研究以荧光蛋白TdTomato为报告基因,经流式分析结果证明优化后的体系较原体系的溢漏表达在蛋白水平上降低7倍左右.将该系统应用于基于小鼠胚胎干细胞的体外牙向分化模型,在诱导因子Dox和稳定配体Shield-1的协同作用下,诱导表达牙齿发育相关转录因子Hand2提高了牙向分化诱导的完成度.     

昆虫杆状病毒可调控表达系统的初步研究

构建了2株用不同启动子表达tet阻遏蛋白Tet-off,并同时带有tet响应元件及报道基因表达框的重组杆状病毒,研究了其受诱导物(强力霉素)调控表达报道基因的情况.W estern b lot和流式细胞仪分析表明,这两株病毒感染昆虫Sf9细胞后,在有诱导物存在时报道基因egfp表达水平明显高于无诱导物时的表达水平,表明Tet-off可调控表达系统可以用于在昆虫Sf9细胞调控相关基因的表达,这项研究为构建更加有效的可调控杆状病毒表达系统提供了基础.     

Investigating the function of Akt by tet-off inducible expression system

A tet-off inducible cell line named BBT derived from BA/F3b cell line was constructed and the effect of this inducible expression system was significant when detected by tet-off responded luciferase reporter gene assay. Then tet-off responded Akt expression plasmid was transfected into BBT cells, and the stable cell lines were screened. The result of Northern blot showed that the expression of akt was significantly inducible. The clone with the best inducible effect was selected and named BBA for investigating the function of Akt. We found that Akt could significantly inhibit zinc-induced decrease of cell viability when assayed by MTT method. And the flow cytometric analysis showed that Akt could markedly repress zinc-induced apoptosis.     

白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。     

Establishment of Jurkat tet-on cell line

Tet-control system is developed to tightly control target gene expression in mammalian cells by using the regulatory elements of tetracycline-repressor of the transposor Tn10 fromE. coli. We have transfected reverse tetracycline-controlled transactivator gene (rtTA) into genome of Jurkat cells and established two Jurkat tet-on cell lines. Induction of luciferase reporter activity with doxycycline, a tetracycline derivative, is dose-dependent with a peak value of 32-fold increment. Establishment of Jurkat tet-on cell lines greatly facilitates quantitative studies on target gene functions in the cells.     

Controlled expression of enhanced green fluorescent protein and hepatitis B virus precore protein in mammalian cells

A novel tetracycline regulation expression system was used to regulate the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) and hepatitis B virus precore protein in the mammalian cell lines with lipofectAMINE. Flow cytometry assays showed that application of the system resulted in about 18-fold induction of EGFP expression in CHO cell lines and 5-fold induction in SSMC-7721 cells and about 2-fold in the HEK293 cells. Furthermore, the effective use of this system for the controlled expression of HBV precore protein gene in hepatocellular carcinoma cells was tested.     

Progress in artificial control system for gene expression

Along with the increasingly wide application of transgenic techniques, new stricter criteria have been raised for controlling the expression of exogenous genes. For these demands, a series of artificial control systems for gene expression have been developed and testified in recent years, which can control exogenous genes expression in exact time and certain level by administration of a specific drug or hormone. The successful construction of these systems offers a practicable method to control precise expression of exogenous gene in organisms, and raises the feasibility of wide application of gene therapy.     

High expression of EPO gene using un-dhfr negative cell

Erythropoietin (EPO) genomic gene was cloned and its expression vector pOP13/EPO was constructed. CHO_K12 cell was transfected by this vector using lipofectin method. A stable expression cell strain C10 cell with the EPO production at 160IU/d in 10\+6 cells were obtained at 400 μg/mL G418. Based on the C10 cell, another vector pHY/dhfr (dihydrofolate reductase) that carries a dhfr gene and a selecting marker of hygromycin B resistant gene was transferred to this cell. Several cell clones were obtained at 200 μg/mL hygromycin B. These cell clones that can express both EPO gene and exogenous dhfr gene were selected under the progressively increased concentration to 1 μmol methotrexate(MTX). Some high EPO expression cell clones were obtained, the highest expression was 2 400 IU/d in 10\+6 cells, 15 times higher than that without MTX pressure. Then, a method of EPO high expression by using un_dhfr negative cell was primarily established. EPO bioactivity was found by using TF_1 cell.