p21对DNA聚合酶δ表达的抑制及其对MCF7细胞增殖和恶性表型的影响

细胞周期抑制因子p21能影响G1/S期转换和G2/M期进程，进而抑制细胞增殖．p21表达增高可以抑制多个DNA复制相关基因表达．DNA聚合酶δ是DNA复制中最为重要的复制酶，p21是否抑制它的表达，并通过这种作用影响细胞增殖及细胞恶性表型的变化，至今还没有报道．本研究观察到p21表达增强的MCF7p21细胞生长速率变慢，血清依赖性增强，细胞的锚定和非锚定依赖性增殖都受到抑制，表明p21表达增加对细胞增殖和细胞恶性表型的产生有重要作用．而Western blot检测发现在p21表达增高的MCF7p21细胞中，聚合酶δ（p125亚基）表达下降．p21高表达抑制POLD1启动子活性，这种抑制作用具有p21剂量依赖效应．这表明p21表达增高对细胞增殖的抑制和细胞恶性表型的影响可能是通过抑制在DNA复制中最重要的聚合酶δ（p125）的表达来实现的．这可能是p21对细胞增殖及恶性表型影响的一个新的调控机制．     

多酚类化合物及其衍生物抗乙肝病毒活性及作用机制研究进展

乙型肝炎病毒(乙肝病毒)作为一种嗜肝DNA病毒,是引起乙型病毒性肝炎(乙肝)的病原体.人体感染乙肝病毒后机体会产生持续的免疫应答,很大程度上会造成慢性乙肝,进而发展成肝硬化甚至肝癌,严重威胁患者的生命健康.天然产物是药物发现的宝库.从天然产物中分离得到的多酚类化合物因含有大量羟基,使其具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老等功能,目前已成为研究热点之一.多酚类化合物及其衍生物(如表没食子儿茶素没食子酸酯、迷迭香酸、没食子酸等)可通过不同的作用机制发挥抗乙肝病毒活性,如抑制病毒吸附、靶向病毒cccDNA,抑制病毒复制转录过程,调控病毒诱导的细胞自噬、细胞凋亡、细胞相关信号通路及氧化应激反应等.对多酚类化合物及其衍生物抗乙肝病毒活性及作用机制研究进行综述,以期为今后抗乙肝病毒新药研发提供一定的参考.     

核不均一性核糖核蛋白H2（hnRNPH2）对单纯疱疹病毒（HSVI）复制影响

本文研究了单纯疱疹病毒（HSVI）在感染与复制过程中影响宿主细胞RNA转录，蛋白表达，进而为病毒的潜伏和持续感染创造必要条件．采用基于2-DE分析，人正常肝细胞L-02细胞核不均一性核糖核蛋白H2（heterogeneous nutlear ribonucleoprotein H2，hnRNPH2）在感染HSVI前后存在表达差异，构建pcDNA-hnRNPH2真核表达载体及hnRNPH2稳定转染的293T细胞系的方法，研究在核不均一性核糖核蛋白H2（hnRNPH2）稳定过表达后对HSVI病毒复制周期的影响．结果表明，病毒滴度和生长曲线显示，hnRNPH2可以显著影响病毒复制周期．过表达hnRNPh2的细胞系与对照相比，其病毒滴度明显下降，hnRNPH2在HSVI病毒复制中起到比较明显的抑制作用，其作用机理还有待进一步研究．     

番茄真核翻译起始因子4E基因RNA干涉及其抗病毒特性研究

植物真核翻译起始因子4E（eIF4E）在蛋白质翻译过程中发挥重要作用．最近研究表明eIF4E在参与植物病毒互作,影响病毒在寄主中复制和侵染过程．文中通过RNA干涉调控番茄eIF4E表达,鉴定eIF4E在植物病毒互作中的作用．根据数据库假设性一致序列（TC171564,TC170275）分别克隆了番茄“中蔬五号”SleIF4E基因及其异构体基因SleIF（iso）4E．构建了SleIF4ERNAi抑制表达载体pSL4D,通过农杆菌介导的方法导入番茄品种“中蔬五号”基因组．PCR检测和Southern blot结果表明,目标基因已整合到番茄基因组中．通过半定量RT-PCR对转基因番茄进行eIF4E表达分析,表明pSL4D转化番茄中eIF4E得到不同程度抑制．转基因植株分别接种PVY和CMV两种病毒,病毒ELISA测定和病毒RNA积累量分析表明,pSL4D转化植株相对于对照组均获得不同程度的病毒抗性,番茄eIF4E参与PVY的复制或侵染寄主过程．就不同病毒而言,RNAi对PVY抗性的调控效果比CMV调控效果好,抑制PIF4E表达可提高植物对PVY的抗性．     

HCV RNA复制过程中5''UTR与3''UTR 作用的初步探讨

构建具有不同类型和长度的5'非编码区(UTR)及3'UTR的丙型肝炎病毒(HCV)全长cDNA克隆,体外转录制备RNA,转染肝癌细胞HepG2,研究不同RNA转录体在细胞内的复制情况。通过RT-PCR与Westernblot等方法证明:蛋白编码区来源于1a基因型并具有1b型5'UTR及3'UTR(全长或缺失98nt保守区)的2种嵌合型HCVRNA,都可以在病毒易感细胞中复制和表达;而以脑心肌炎病毒(EMCV)内核糖体进入位点(IRES)替代HCV5'UTR的嵌合型RNA转染细胞,检测不到病毒正、负链RNA与蛋白表达。以上结果说明HCV1b型5'UTR与3'UTR可以支持1a型病毒RNA的正常复制,3'UTR保守区的存在与否,对病毒复制影响不大。     

斜纹夜蛾核多角体病毒感染甜菜夜蛾细胞的研究

 研究发现斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV）不能成功感染同属甜菜夜蛾（S. exigua,Se）昆虫,为深入研究SpltNPV在离体Se301细胞中的感染进程以及病毒感染失败的原因,对感染后Se301细胞进行DNA复制、病毒基因转录以及病毒蛋白表达等检测。结果显示被感染的Se301细胞中病毒完成了DNA的复制和病毒早、晚期基因转录,但检测不到极晚期基因多角体基因（polyhedrin）的表达,病毒的蛋白表达受阻从而影响了病毒完成复制周期。 研究发现病毒蛋白表达受阻是SpltNPV在Se301细胞中无法形成子代病毒,完成整个病毒复制的主要原因,这为深入研究其感染失败机理奠定了坚实基础。     

绿茶多酚表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）体外对抗乙肝病毒复制的能力

研究目的：乙肝是尚未解决的公众健康问题,需要开发新型抗病毒药物。本研究拟从天然植物绿茶中寻找有效、经济、毒副作用低的抗乙肝病毒药物。创新要点：研究方法：重要结论首次以HepG22．2．15细胞为载体,发现EGCG对乙肝病毒HBsAg、HBeAg和HBVDNA的选择性作用。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量,采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测上清和细胞内HBVDNA的含量。EGCG的浓度在0．11～0．44μmol／ml（即50～200μg／ml）的范围内能有效抑制HepG22．2．15细胞中HBsAg和HBeAg的分泌,其效果甚至优于浓度为0．87μmol／ml（即200μg/ml）的拉米夫定（3TC）,并且具有时间和剂量依赖性。同时,EGCG也能抑制胞外HBV DNA的表达。研究结果表明,EGCG具有良好抗病毒活性和低毒副作用,有望开发成为一种新的抗病毒药物。     

AcMNPV p95基因一段339 bp序列在病毒复制中的作用

杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的p95基因编码的P95蛋白是病毒核衣壳的组成部分,也是虫体经口感染相关因子PIF(Per os Infectivity Factor)复合体的组成部分.前期研究表明,完整的P95蛋白对病毒的复制是非必需的,其中一段450bp的序列可以部分弥补p95基因的作用.本研究将p95基因一段339bp的片段(Core339,AcMNPV基因组位置:69 576~69 914bp)以正反两个方向分别插入到p95基因敲除的AcMNPV基因组中多角体位点的polyA之后,构建了两株重组病毒vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-.该两株病毒能在Sf9细胞中正常复制,复制水平与p95基因正常的AcEGFP相当,但复制速度较慢.重组病毒感染细胞的Western blot分析未检测到P95蛋白的表达.这一结果表明P95蛋白的缺失对病毒在细胞中的复制没有显著影响,但核心片段Core339对于病毒复制具有关键作用.     

自主性细小病毒非结构蛋白NS1对转化细胞的毒性及其调控DNA复制和转录的机制

自主性细小病毒具有对转化细胞专一的毒性,它的非结构蛋白ＮＳ１在其中起着重要的作用．在病毒生活周期中ＮＳ１有着多种功能,包括调控ＤＮＡ 的复制和转录．其机制包括ＮＳ１对ＤＮＡ 复制的反式抑制、对基因表达的反式抑制和对转录的反式激活     

335例乙型肝炎患者血清HBV-DNA定量与乙肝病毒标志物的相关性分析

目的:探讨乙型肝炎患者血清HBV-DNA定量与乙肝病毒标志物的关系。方法:对335例乙型肝炎患者分别用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测血清HBV-DNA含量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清乙肝病毒标志物,并对结果进行统计学分析。结果:大三阳组HBV-DNA阳性率及含量显著高于其他组(P<0.01);小三阳组HBV-DNA阳性率及含量显著低于大三阳组(P<0.01),但与HBsAg、HBcAb阳性组比较差异无统计学意义(P>0.05);HBeAg阳性组HBV-DNA阳性率显著高于HBeAg阴性组(P<0.01)。结论:只有将HBV-DNA定量检测和乙肝病毒标志物有机的结合,才能为乙型肝炎的临床感染、病毒复制、传染性强弱以及抗病毒药物的疗效观察提供可靠的判断依据。     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

汉滩病毒G1重组腺病毒的表达及其免疫学特性研究

将汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G1重组腺病毒(Adeno-G1)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物;并进一步将其免疫Balb/c小鼠。结果可检测到HTNV糖蛋白G1在VeroE6细胞中表达;用该重组腺病毒免疫小鼠,结果表明免疫小鼠体内可诱导产生抗汉滩病毒G1特异性抗体,同时微量细胞培养中和实验结果表明重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体,但淋巴细胞增殖反应不明显。说明Adeno-G1免疫小鼠后,主要刺激机体产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,但刺激机体产生特异性的细胞免疫应答不明显,为HTNV基因工程疫苗的研究提供了实验基础。     

汉坦病毒CTL多表位重组腺病毒的构建及免疫学分析

目的：构建含汉坦病毒M基因（编码糖蛋白G1）和部分S基因（编码核蛋白主要抗原区段）以及S基因的多个 CTL表位的多种重组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究。方法：构建含目的基因的重组腺病毒载体,并对其表达产物进行鉴定。利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/C小鼠,通过多种免疫学方法检测其免疫反应。结果：成功表达出可被汉坦病毒核蛋白特异性单抗(mAb)及糖蛋白G1 的特异性单抗所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效刺激针对汉坦病毒NP及GP的免疫应答;同时结果表明在CTL多表位间加入间隔序列AAY的重组腺病毒免疫小鼠能产生更高的细胞免疫应答。结论： 构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力。间隔序列AAY对于各CTL表位的分隔有效地提高了重组腺病毒的免疫效果。     

鸡腺病毒内蒙古分离株六邻体蛋白基因片段的合成和分子克隆

根据鸡１０型腺病毒以及人２、５、４０、４１型腺病毒、牛３型、鼠１型腺病毒六邻体蛋白基因序列，选择保守区，设计和合成一对引物，以鸡腺病毒内蒙古分离株基因组ＤＮＡ为模板，进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到预期大小的０．５５ｋｂＤＮＡ片段．将此ＤＮＡ片段克隆于ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ位点，筛选重组质粒，进行限制酶切分析和ＰＣＲ检测，得到含有六邻体蛋白基因片段的重组质粒，为进一步开展此病毒分子生物学研究和分子生物学诊断技术的建立创造了条件     

贴壁及悬浮培养的Trex-293细胞生长及其重组腺病毒制备产率的比较分析

为了提高病毒产率并避免制备的重组腺病毒产物中残留的动物血清,将贴壁生长的Trex-293细胞用无动物血清的CD293培养基在搅拌式培养瓶中悬浮培养。分析比较其生长特征及不同条件下的病毒产率。结果表明悬浮培养的细胞生长为稳定状态的时间比贴壁培养时稍长,但每次以(4—6)×105cells/mL密度传代。(3—4)d后基本达到2×106cells/mL,21 d达3×106cells/mL以上,比贴壁细胞密度约高3倍。培养初期,悬浮细胞存活率稍低,培养14 d开始维持90%以上,细胞倍增时间约32 h。而贴壁细胞存活率是基本维持在95%以上。重组腺病毒以200,500和1 000 VP/cell的比例感染悬浮细胞所获产率均值各为18 000,14 000和990 VP/cell,而1 000 VP/cell的比例感染贴壁细胞所获产率均值为10 500 VP/cell。结论为Trex-293细胞用无动物血清的培养基在搅拌式培养瓶中可悬浮培养,当重组腺病毒感染比例为200 VP/cell,感染后48 h,细胞存活率50%时收获有利于提高病毒产率,且高于感染贴壁细胞所获产率。     

双靶向溶瘤腺病毒对肿瘤细胞及正常细胞的杀伤差异性研究

为了降低溶瘤腺病毒对正常细胞的杀伤作用，提高临床应用上的安全性，构建了一种双靶向溶瘤增殖型腺病毒AdCN103，以人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子代替野生型腺病毒E1A自身的启动子，同时在E1A区缺失保守区域CR2的24 bp.并将AdCN103与两种相应的单靶向溶瘤增殖型腺病毒AdCN101和AdCN102，以及野生型WtAd5相比较，通过MTT,结晶紫以及病毒子代复制实验，观察它们对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤性差异.结果表明，AdCN103只能严格地在肿瘤细胞中复制，对肿瘤细胞有较好的杀伤作用，对正常细胞的杀伤性较野生型腺病毒及单靶向腺病毒都弱.实验证明AdCN103能作为新一代的安全的双靶向溶瘤腺病毒载体应用于肿瘤治疗.     

重组hFGF-7腺病毒对角质形成细胞的生物学效应

目的:研究重组腺病毒导入人成纤维细胞生长因子7(hFGF-7)对人皮肤角质形成细胞(HaCat)的生物学效应.方法:通过倍比稀释和感染实验,测定重组腺病毒rAd-hFGF-7的滴度;流式细胞术检测重组腺病毒感染HaCat细胞的感染效率;MTT法检测rAd-hFGF-7对HaCat细胞增殖的影响;重组腺病毒对HaCat细胞周期的影响通过流式细胞术进行检测.结果:高滴度重组腺病毒可高效感染HaCat细胞,其促细胞增殖作用随着重组腺病毒MOI值的增加而增强,当MOI值为50时,感染细胞进入S期和G_2期的细胞比率显著增加.结论:重组腺病毒rAd-hFGF-7可促进HaCat细胞的增殖,改变HaCat细胞周期.     

Novel rAAV production system with low contamination of helper virus

The Cre-loxP system was introduced in the production of recombinant AAV(rAAV).Defective adenovirus AdLC was used as the helper virus.While doing the mass production of recombinant AAV carrying FGFP or human clotting factor Ⅸ（hFⅨ)gene,the generation of helper virus was significantly limited,it increased the simplicity of rAAV purification.The results from in vivo study demonstrated the superiority of this method.This system provides a novel approach for the application of rAAV system in gene therapy.     

Construction and in vitro Study of an E1B-Defective Adenovirus

0　IntroductionTheconceptofvirotherapy ,anapproachtocurecancerwithviruses,wasinspiredlateofthelastcenturybytheobser vationofoccasionaltumorregressionsincancerpatientssufferingfromvirusinfectionsorreceivingvaccinations[1 ] .Conditionalin tratumoralreplicationofaviralagentmayleadtoimprovedeffica cyovernon replicatingagentsbecauseoftheinherentnatureofthetreatmentwithvirusmultiplication ,lysisoftheinfectedcan cercellandspreadtoadjacentcells.SincetheleadingeffortsofOnyxPharmaceuticals (Richmond ,…     

Construction and<Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis> study of an E1B-defective adenovirus

An E1B-defective adenovirus named rl/Ad was constructed by homologous recombination.The construction,selection and propagation of recombinant virus was done in the human embryonic kidney 293 cells (HEK293).The in vitro study demonstrated that the recombinant virus has the ability to replicate in and lyse some p53-deficient human tumor cells such as the human glioblastoma tumor cells (U251) and human bladder tumer cells (EJ) but not in the normal cells with functional p53 such as the human fibroblast cells (MRC-5).Also,based on the cytopathic effect (CPE),it was demonstrated that the U251 cells were more sensitive to the infection of rl/Ad than that of EJ cells under identical conditions.In this paper,it was found that rl/Ad could be very useful in studying the in vitro selective replication of E1B-defective adenovirus.This may help to determine the safety of using any E1B-defective adenoviruses in cancer gene therapy.