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1.
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脱毛碱性蛋白酶(DHAP)的饱和突变
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黄 蓉 冯 红《四川大学学报(自然科学版)》,2015年第52卷第5期
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本实验在同源建模和氨基酸序列比对的基础上, 选取脱毛碱性蛋白酶（DHAP）8个氨基酸位点进行饱和突变. 通过牛奶平板和96孔板发酵筛选， 获得了4个催化特性改良的突变体, 测序鉴定为D248F, D248S, M233L和W214K. 利用酪蛋白和合成肽(AAPL pN)作为底物, 对这些突变体进行了评价, 结果表明D248F、D248S、W214K在常温(28℃)下的酪蛋白水解活性提高; M233L在常温、高温(50℃)的酶活以及热稳定性都有增加. 同时, M233L和W214K在25℃和50℃水解AAPL pN的酶活也分别得到了不同程度的提高.
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2.
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棒状链霉菌扩环酶R306位点的定点突变
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莫宏波 伍晓斌 周翔 刘誉《暨南大学学报(自然科学与医学版)》,2006年第27卷第2期
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目的:通过对棒状链霉菌的脱乙酰氧基头孢菌素C合酶(DAOCS)C末端R306位点突变,改变酶的活力和底物专一性。方法:利用生物信息学和空间结构分析推测,利用定点突变技术,对DAOCS的C-末端R306位点进行定点突变。结果:将DAOCS的C末端R306位点突变为其它3种性质相异的氨基酸,显示酶的活力和底物专一性都有一定改变。结论:DAOCS的C末端修饰对于提高酶活力或改变酶的底物专一性是一个非常有效的策略。
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3.
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环糊精水解酶cds1-3底物通道氨基酸的定点突变研究
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汤宏赤 莫莉 闭海 林丽华 郭媛 庞浩《广西科学》,2019年第26卷第4期
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本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变。通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸。采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形成、底物结合以及底物通道相关的氨基酸Glu66、Pro48、Phe289为突变位点,反向PCR构建pSE380/E66G、pSE380/P48H、pSE380/F289A表达质粒并进行表达,获得酶活突变体并与原始酶进行底物特异性比较分析。其结果显示,突变酶E66G降解大分子底物木薯淀粉和支链淀粉的相对酶活力分别提高26.96%和23.15%,而对小分子底物普鲁兰糖的水解能力下降13.14%。因此,cds1-3是一个能水解大分子底物的特殊环糊精水解酶,氨基酸Glu66是cds1-3水解大分子支链淀粉的关键氨基酸之一。
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4.
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大肠杆菌嗜盐α-淀粉酶基因的分子改造及其酶学特性
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李剑龙 杨媛 吴昊 汤宏赤 韦宇拓《广西科学》,2016年第23卷第1期
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[目的]对大肠杆菌Escherichia coli嗜盐α-淀粉酶基因进行改造,并探索嗜盐a-淀粉酶的嗜盐特性.[方法]从非嗜盐的大肠杆菌JMl09中克隆到一个嗜盐α-淀粉酶基因k6并进行重组表达.通过同源建模,确定Na+结合位点上的氨基酸残基,并对相应位点进行定点突变.最后对突变酶的酶学性质进行研究.[结果]相对于野生酶,突变酶更加嗜盐,其最适NaC1浓度由2 mol/L增加到3 mol/L,最适pH值为7,最适温度为50℃,酶活力为4 831 U/mg,提高近4倍.经HPLC检测,突变酶与2％(W/V)可溶性淀粉反应后的产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的混合物.[结论]嗜盐α-淀粉酶基因k6的嗜盐特性与Na+结合位点具有直接联系.
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5.
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定点突变提高豆豉纤溶酶的酶活力和底物特异性的研究
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崔堂兵 郭勇 罗文华 舒薇《自然科学进展》,2008年第18卷第7期
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以pBE—DFE质粒为模板，采用反向长距离PCR技术对豆豉纤溶酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme，DFE)基因进行定点突变，使位于酶的底物结合区第156位的谷氨酸和第166位的甘氨酸分别替换为丝氨酸和丙氨酸，使临近酶的底物结合区的第169位甘氨酸残基替换为丙氨酸，获得了三个突变体E156S,G166A和G169A.将含突变基因的表达载体转化枯草杆菌WB800，构建了豆豉纤溶酶基因突变体的表达菌株WB800(E156S)；WB800(G166A)和WB800(G166A).将3种表达菌株进行液体发酵培养，结果发现发酵上清液中纤溶酶的纤溶活性为460,790和900U/mL，分别是未突变酶活性(660U/mL)的70%，115%和136%；3种突变酶对合成底物的H-D-Val-Leu-Lys-pNA的酰胺水解活性是未突变酶的17%，125%和121%.
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6.
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大肠杆菌碱性磷酸酶突变体的构建及其结构与功能研究 被引次数：2
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王秋颖 李宁 向本琼《北京师范大学学报(自然科学版)》,2007年第43卷第6期
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以大肠杆菌碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)高活性突变株(L138PG233S)为亲本,采用重叠延伸PCR的方法进行定点突变,成功获得了氨基酸替换突变体3个,并对它们的酶活性、特性、内源荧光发射峰等与亲本酶进行了比较分析.结果发现:与亲本酶相比,突变体酶的酶活性降低了18%～85%,Vmax值降低,Km增加,内源荧光发射峰λmax增大等.与亲本酶相同,Zn2 ,Mn2 ,Mg2 仍是它们的激活剂,Na3PO4是它们的抑制剂;这些实验结果说明突变体酶活性的降低直接与其构象变化有关,被替换的氨基酸在维持碱性磷酸酶的结构和功能方面具有特定的作用.
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7.
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产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)钼铁蛋白α-423~(Ile)位点的突变导致固氮酶催化活性降低
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郭青娟 彭涛 常天驹 张刚 姜伟 李颖 李季伦《科学通报》,2014年第13期
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基于前期对固氮酶催化过程中存在两条电子传递通路的推论,探索从与P原子簇共价相连的β-93Cys出发至FeMoco之间重要的氨基酸位点.通过分析固氮酶钼铁蛋白的结构,利用体外定点突变和基因替代技术,将产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)固氮酶β-102Asn,α-431Lys和α-423Ile位点分别替换为β-102Ala,α-431His和α-423Pro,获得Nβ102A,Kα431H和Iα423P突变株.3个突变对细菌固氮生长有不同程度的影响,其中Iα423P突变株几乎无固氮生长,细胞乙炔还原活性显著下降;在42 L发酵罐中培养,其细胞最高固氮酶活性仅为野生型菌株的1/6;qRT-PCR检测发现此突变株nifD基因4倍的上调表达.分离纯化Iα423P钼铁蛋白,其最高C2H2和H+还原水平分别为野生型的13%和21%.根据以上研究结果推论,突变固氮酶的催化活性显著降低,或与直接打破α-423Ile与高柠檬酸长臂之间的氢键有关,推测α-423Ile是固氮酶催化底物还原过程中,电子经高柠檬酸长臂进入活性中心Mo位的入口氨基酸.
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8.
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海洋细菌Pseudomonas sp.7-11产碱性蛋白酶的研究 被引次数：1
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冯静 荆谷 谢慧君 孔健 马桂荣《山东大学学报(理学版)》,2002年第37卷第3期
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本文研究了海洋细菌Pseudomonas sp.7-11产碱性蛋白酶的发酵条件及调控机制，并对该蛋白酶进行了分离纯化，实验结果显示，7－11为好氧菌，具有某些嗜低温的特性，而且适宜在偏碱性的条件下生长并产酶；酪蛋白培养基适合该菌株产酶；K^＋对产酶起关键作用；复合氨基酸对产酶有抑制作用，发酵液经盐析和离子交换层析等得到了两个活性峰，其中一个峰达到电泳纯，因此该菌产生蛋白酶不止一种。
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9.
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豆豉纤溶酶纤溶活性的定向进化研究 被引次数：2
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张少平 崔堂兵 陈亮 郭勇《华南理工大学学报(自然科学版)》,2010年第38卷第9期
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通过易错PCR方法向来源于枯草芽孢杆菌DC-12的豆豉纤溶酶基因中引入突变并构建突变体库.利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA以酶活力为指标对突变体库进行筛选,通过三轮易错PCR最终获得一株酶活力提高的突变株M324.序列分析表明突变体M324酶基因发生了六处碱基突变,其中四处突变发生氨基酸取代,另两处为无义突变.通过SWISS-MODEL Repository模拟突变酶的结构显示,三个突变氨基酸位于回环结构上,一个位于α螺旋上.纤维蛋白平板法测定纤溶酶活,结果显示突变酶的比活力是野生型的2.44倍.
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10.
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紫红红球菌9α–羟化酶loop对酶活性的影响
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刘扬 申雁冰 王九彬 王敏《天津科技大学学报》,2018年第1期
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3–甾酮–9α–羟化酶是转化雄甾–4–烯–3,17–二酮生成9α–羟基雄甾–4–烯–3,17–二酮的关键酶,其加氧酶组分在底物进入酶活性中心入口处,存在一个由16个氨基酸构成的柔性loop.为了明晰loop对酶活性的影响,利用定点突变技术对loop上结构变化较大的氨基酸进行研究,解析出了各氨基酸的作用,T224、N225、Y226与周围α5螺旋和β折叠存在一定相互作用,共同调节底物通道与底物运送能力;D227和D228起到支撑固定loop结构的作用,使T224–Y226能与其周围的氨基酸产生相互作用.这为进一步采用蛋白质工程改造9α–羟化酶提供了理论依据.
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11.
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罗非鱼鱼鳞胶原多肽的优化制备及其生物活性研究
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李 灵 徐梁棕 汪少芸《福州大学学报(自然科学版)》,2018年第46卷第1期
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以罗非鱼鱼鳞为原料,采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合水解,在单因素试验的基础上,采用响应面法优化酶解工艺,制备鱼鳞胶原多肽.测定胶原多肽的抗氧化活性、细菌低温保护活性、氨基酸组成及相对分子质量分布.结果显示,最适酶解条件为:底物质量浓度30.6 mg·m L-1、胰蛋白酶和碱性蛋白的加酶量分别为1.44和0.70 mg·m L-1、酶解温度50℃、pH值8.5、酶解时间6.35 h.酶解胶原多肽对DPPH自由基和羟基自由基的半数清除质量浓度(IC50)分别为2.89和3.54 mg·m L-1.经过细菌低温保护试验,当胶原多肽质量浓度为1 mg·m L-1时,嗜热链球菌的存活率达到75.6%.鱼鳞胶原肽相对分子质量分布显示,78%多肽片段的相对分子质量分布于180~2 000 u之间.氨基酸组成分析显示鱼鳞多肽富含甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸及天冬氨酸等,这些特定的氨基酸与胶原多肽的抗氧化活性、细菌低温保护活性相关.
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12.
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小球藻Chlorella variabilis NC64A二酰甘油酰基转移酶基因的克隆表达与功能研究
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杨金水 高全秀 李兆胜 邢冠岚 袁红莉《北京大学学报(自然科学版)》,2016年第2期
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为了揭示二酰甘油酰基转移酶(DGAT)在小球藻油脂合成过程中的作用,对单细胞小球藻Chlorella variabilis NC64A的二酰甘油酰基转移酶进行原核克隆表达及功能初步研究.结果表明,其编码序列为894bp,编码297个氨基酸,表达蛋白的表观分子量为33 kDa,pI 9.48.保守结构域分析表明,该蛋白属于Lysophospholipid acyltransferases (LPLATs)超家族,具有二酰甘油酰基转移酶活性,序列位点H68,L71,F76,R94,I97和GAA (144-146)组成特定的酰基受体结合口袋,能够结合酰基-酰基载体蛋白(ACP)或者酰基辅酶A上的酰基,催化三酰甘油合成的最后一步.表达蛋白与SsPDAT和AtPDAT的序列相似性分别为32％和24％,表明该蛋白可能具有磷脂酰甘油酰基转移酶(PDAT)活性,能利用磷脂上的酰基合成三酰甘油.因此,采用薄层层析方法以L-α-磷脂酰胆碱和1,2-二油酰-srn-甘油为底物,检测到其确实具有PDAT活性,表明限氮条件下NC64A中DGAT的PDAT活性可能促进了膜脂降解耦合三酰甘油的合成.
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13.
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K148与K149对黑曲霉NRRL3135植酸酶A与植酸结合机制的影响
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康伟 马宝全《南开大学学报(自然科学版)》,2013年第1期
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为了研究黑曲霉NRRL3135植酸酶A K148与K149对底物与酶的结合反应的影响,构建了一个单位点突变体(K148E)和一个双位点突变体(K148E和K149E),由于带电的氨基酸残基发生变化,造成这2个突变体的酶活性都有不同程度的减少,利用InsightII软件模拟了2种突变体酶的3-D结构,发现酶分子突变位置的表面电势有明显的改变.这2个α-螺旋(141～160)位点的改变可能降低了活性中心附近的底物浓度,减缓了底物与活性中心的反应速度.
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田菁根瘤菌嗜盐α-淀粉酶的基因克隆表达与分子改造
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杨媛 姚甜甜 熊海涛 杜丽琴 韦宇拓《广西科学》,2017年第24卷第2期
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[目的]克隆表达田菁根瘤菌嗜盐α-淀粉酶基因,并对其进行基因改造,为探索与嗜盐性相关的氨基酸位点提供参考.[方法]从田菁根瘤菌及周围土壤的宏基因组中克隆到一个命名为RSA的极端嗜盐淀粉酶.通过与同源性为75.33%的嗜盐α-淀粉酶K6的序列比对发现,RSA-D205位点与已报道的K6-N204(嗜盐相关的氨基酸位点)相似,从而对其进行定点饱和突变以研究相关酶学性质.[结果]共获得17个突变子,其最适NaCl浓度较RSA均有不同程度的降低.RSA-D205R、RSA-D205C酶反应温度高达80℃,拓宽了其应用范围.[结论]RSA-D205氨基酸残基位点与Na+结合位点有一定的联系;另外,精氨酸(R)、半胱氨酸(C)对淀粉酶的高温改造具有参考价值.
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15.
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草鱼皮酶解工艺及水解物对嗜热链球菌增殖作用研究
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宋益善 陈建康《科学技术与工程》,2016年第16卷第33期
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首次研究了水产品蛋白酶解物对乳酸菌的增殖作用。选择草鱼皮为原料,通过蛋白酶Protease P “Amano”6对其进行酶解,其水解物可以作为培养嗜热链球菌增殖的氮源。同时以水解度和水解物对嗜热链球菌的增殖效果为评价指标,并利用正交实验对酶解工艺进行了优化。结果表明,蛋白酶Protease P “Amano”6对草鱼皮最佳的酶解条件为：加酶量3%、料水比1∶3(m/V)、酶解时间7h、pH 8.0、反应温度45°C。
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阿特拉津氯水解酶基因的定点诱变和酶活力检测 被引次数：3
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陈德富 陈喜文 蔡宝立《南开大学学报》,2004年第37卷第3期
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阿特拉津氯水解酶(AtzA)是一种对除草剂的生物降解和环境净化有重要意义的酶．采用定点诱变方法将假单胞菌ADP株的atzA基因第832位碱基(鸟嘌呤)诱变成腺嘌吟，然后将其插入表达载体pET21b( )，并在大肠杆菌中表达．表达的蛋白特性研究表明：AtzA或AtzA—NK融合蛋白系水溶性蛋白，很容易通过Ni—NTA Magnetic Agarose Beads分离纯化．采用阿特拉津脱氯反应产生HCl而引起pH指示剂颜色改变的测定方法能方便地对其酶活力进行定量．酶活力结果表明，突变酶的比活力与假单胞菌ADP菌株的AtzA相比没有明显改变，暗示突变位点(第278位缬氨酸突变成甲硫氨酸)不是酶的活性中心或底物结合部位。
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中国蛤蜊消化系统的组织学与组织化学研究 被引次数：4
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崔龙波 孔俊 侯竹美 周雪莹《烟台大学学报(自然科学与工程版)》,2005年第18卷第2期
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为探讨中国蛤蜊的消化生理,用组织学和组织化学方法对其消化系统进行了研究.消化道粘膜上皮由纤毛柱状细胞和数量不等的粘液细胞组成.胃和肠纤毛柱状细胞呈现蛋白酶、脂酶、非特异性酯酶和碱性磷酸酶活性.消化腺腺上皮由嗜碱性细胞和消化细胞组成.嗜碱性细胞含丰富的RNA和蛋白质;消化细胞呈现蛋白酶、脂酶、非特异性酯酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性,表明该细胞能进行细胞内消化.
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甘蔗叶灼病解毒蛋白——AlbD S40位点饱和突变分析
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雷凯健 刘子铎 洪玉枝《河南大学学报(自然科学版)》,2008年第38卷第4期
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利用overlapping PCR技术对甘蔗叶灼病解毒蛋白-AlbD酶S40关键位点进行饱和突变,共获得19种突变子,并测试不同突变子的脱毒活性和酯酶活性.结果显示,S40A和S40R突变子分别使AlbD酶脱毒活性提高12.8%和9.5%.以对硝基苯丁酸酯为底物,S40Q可使AlbD酶酯酶活性提高20%;以对硝基苯戊酸酯为底物,S40G可使其活性提高30%.
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19.
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嗜热酯酶EstTs1的远源三维结构模建及分子对接
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詹冬玲 邵鸿泽 韩葳葳 刘景圣《吉林大学学报(理学版)》,2011年第49卷第6期
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利用Phyre网络服务器,构建嗜热酯酶EstTs1的三维结构,并通过分子动力学优化构型,得到了可靠的构型.分子对接研究表明,p-硝基苯基丁酸酯是EstTs1的最适底物,其大小正适合EstTs1的活性口袋.Thr111是底物与酶结合的重要残基,与底物形成了氢键;Ser85是重要的催化残基.
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20.
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一株碱性脱毛蛋白酶产生茵的筛选及系统发育分析
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王耿 方柏山 张婷婷 靳鸿蔚 刘桂兰《华侨大学学报(自然科学版)》,2009年第30卷第3期
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经过采集土样，分离、筛选得到一株产碱性蛋白酶的菌株，编号为A607．通过摇瓶发酵，对发酵上清液进行酶活测定和脱毛实验，证实所产生的酶具有蛋白酶水解活性和良好的脱毛能力，其酶活达到263．39／μkat·L^-1、比活力为1215．24／μkat·g^-1 16SrDNA序列分析表明，该菌株与Bacillus pumilus具有高达99％的相似性．用PHYLIP程序将该菌株与报道的相关碱性蛋白酶产生菌进行系统发育进化分析，发现菌株A607与Bacilluspumilus处于同一分支．
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