牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定

用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.     

Neuritin毕赤酵母分泌表达系统的构建

为构建Neuritin毕赤酵母分泌表达系统,进一步得到高纯度的具有天然活性的Neuritin蛋白提供实验基础。采用人工合成去除信号肽的neuritin基因并在N端引入His标签序列,两端引入Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点,克隆至p PIC9K分泌型表达载体。重组质粒经PCR与测序鉴定正确后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,经MD平板与G418平板筛选阳性重组子,抽提毕赤酵母基因组PCR鉴定重组质粒的插入。结果显示,p PIC9K-neuritin重组质粒经测序鉴定完全正确,电转后成功插入毕赤酵母基因组中。由此可知,成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

转甲状腺素蛋白基因在毕赤氏酵母中的非融合表达

用限制酶将pSK TTR质粒上TTR基因切下,分别插入分泌型载体pPIC9和pPIC9K.将重组的pPIC9K TTR用BglⅡ酶切后,转化PichiapastorisGS115菌株,筛选获得G418高抗性转化子.转化子经摇瓶发酵,上清液用SDS PAGE检测,有明显的rTTR表达.经DEAE sepharoseF.F.离子交换柱和Superdex75分子筛层析,得到蛋白纯度大于95%的rTTR.经Westernblotting,分子质量和等电点测定等证明,毕赤氏酵母表达的rTTR与人血浆提取的TTR极为相似.     

表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.     

转甲状腺素蛋白基在毕赤氏酵母中的非融合表达

用限制酶将pSK-TTR质粒上TTR基因切下，分别插入分泌型载体pPIC9和pPIC9K，将重组的pPIC9K-TTR用BglⅡ酶切后，转化pichia pastoris GS115菌株，筛选获得G418高抗性转化子，转化子经摇瓶发酵，上清液用SDS-PAGE检测，有明显的rTTR表达，经DEAE-sepharose F.F.离子交换柱和Superdex75分子筛层析，得到蛋白线纯度大于95%的rTTR，经Western Boltting，分子质量和等电点测定等证明，毕赤氏酵母的表达rTTR与人血浆提取的TTR极为相似。     

重组人细胞色素P450 2C9在毕赤酵母中的胞内表达

以含有CYP2C9基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板,并在人细胞色素P4502C9的5’端插入kozak序列及3’端6×His标签进行PCR扩增,克隆至真核表达载体pPIC3.5K,利用电激法将经Sal I线性化的重组质粒pPIC3.5K-2C9转化至毕赤酵母GS115中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株,甲醇诱导毕赤酵母GS115/pPIC3.5K-2C9的表达,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物.结果表明:含有重组质粒的重组pPIC3.5K-2C9表达了大小为55KD的目的蛋白,与预期大小相符,说明人细胞色素CYP2C9可在毕赤酵母的胞内表达.     

黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

鱼类抗菌肽hepcidin具有广谱抗菌活性.利用PCR技术扩增获得了黑鲷抗菌肽hepcidin (AS-hepc2)的前体肽和成熟肽 cDNA 序列,片段大小约250 bp.将其与毕赤酵母(Pichia pastoris) pPIC9K 质粒连接,构建了分泌表达载体pPIC9K/AS-hepc2 .电击法转化重组表达载体,经过G418筛选和选择性培养基以及PCR鉴定,得到的克隆子都为Mut+.以甲醇诱导pPIC9K/AS-hepc2,分泌表达上清中获得10 ku左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin的前体肽和成熟肽的大小相符.表达试验证明,随时间的延长,表达产物量增多,至120 h 达到高峰.表达产物具有很强的热稳定性.用抑菌圈法测定重组蛋白Pro-AS-hepc2 的抗菌活性,发现能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长.     

优化合成有机磷水解酶opd p基因在毕赤酵母中的表达

拟验证通过密码子优化有机磷水解酶(opd)基因,和生物砖方法构建opd多拷贝载体,以提高在毕赤酵母中的表达量.将原始的opd基因依照毕赤酵母偏爱密码子设计合成新的有机磷水解酶基因,并在C端添加了6个His-Tag融合蛋白标签.所合成的opd p基因全长1 149 bp(base pair).基因克隆入p HBM905BDM毕赤酵母表达型质粒,成功构建重组表达质粒p HBM905BDM-opd p,以及多拷贝表达质粒p HBM905BDM-opd p-2C,p HBM905BDM-opd p-3C,p HBM905BDMopd p-4C,转化毕赤酵母感受态细胞GS115.实验结果表明,经甲醇诱导后,在AOX1(乙醇氧化酶基因)启动子调控下,获得OPD P蛋白分泌表达,Western Blot检测4个转化的菌株中都表达了目的蛋白,且两拷贝表达量较一拷贝有提高,达到0.2 U/m L.但是随着拷贝数的进一步增加表达量呈现下降的趋势.     

胸腺肽α1在毕赤酵母中的表达及纯化

采用基因工程菌发酵制备胸腺肽α1(Tα1).将人工合成的Tα1单体基因,连接到pPIC9K质粒上,构建表达载体pPIC9K-Tα1,转化毕赤酵母GS115,重组菌经甲醇诱导表达,取发酵液上清,过DEAE52、Sephade-xG-25柱纯化后获得目的蛋白.Tricine-SDS-PAGE和HPLC结果表明Tα1基因在毕赤酵母中得以表达,表达量为4.8mg/L.     

肠道病毒71型SHZH03株VP1基因在毕赤酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增得到肠道病毒71型(EV71SHZH03)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒VP1/pPIC9K,转化Pichia pastoris 酵母宿主菌Gs115,以Myc-Tag多克隆抗体作为一抗,利用双层滤膜法筛选酵母转化子.甲醇诱导表达.SDS-PAGE分析显示:表达产物的分子量约为30000,与天然VP1大小一致,ELISA实验表明,表达上清液可与EV71患者急性感染期血清呈阳性反应,表明重组蛋白VP1具有免疫原性.