人野生型p53基因的克隆及原核表达

利用RT PCR方法由人外周静脉血淋巴细胞中获得人p53 cDNA片段, 并将其克隆入原核表达载体pQE40中, 构建重组质粒pQE40-p53; 转化于E.coli M15宿主菌, 经IPTG诱导, 表达了N端融合6His的p53融合蛋白. 利用6His与Ni²⁺高亲合力结合的性质, 经镍柱纯化、 透析袋分级透析复性、 Western Blot鉴定, 结果表明获得了纯化的6His-p53融合蛋白.
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定点突变内皮抑素Zn2+的结合位点及突变基因的克隆表达

从人胚肝组织中提取总RNA, 以逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法获得人内皮抑素编码序列, 采用定点突变技术将His2和His4双突变为Leu2和Val4. 将突变基因cDNA插入含有T7启动子的质粒pET-28b中构建表达质粒pMendo, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 筛选表达菌株BL21-Mute, 表达菌株经IPTG诱导后以包涵体方式产生大量内皮抑素突变蛋白. SDS-PAGE分析表明, 表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白质的30%. 复性、 纯化的内皮抑素突变蛋白纯度达到98%, 失去抑制人脐静脉内皮细胞增殖的活性.     

蛇神经毒素在毕赤酵母中的分泌表达及其分离纯化

文中主要研究了毕赤酵母基因工程菌的构建及其发酵表达产物蛇神经毒素的分离纯化条件。蛇神经毒素编码基因由本实验室设计、合成，并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His-Mut+)，筛选His+Muts型菌株，经诱导表达，产物进行SDS- PAGE电泳鉴定，相对分子质量与理论值一致，目标蛋白经小试发酵产量可达350mg/L。利用超滤、离子交换树脂及分子筛分离纯化，产物经高效液相色谱(HPLC)分析纯度达92%。     

Neuritin毕赤酵母分泌表达系统的构建

为构建Neuritin毕赤酵母分泌表达系统,进一步得到高纯度的具有天然活性的Neuritin蛋白提供实验基础。采用人工合成去除信号肽的neuritin基因并在N端引入His标签序列,两端引入Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点,克隆至p PIC9K分泌型表达载体。重组质粒经PCR与测序鉴定正确后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,经MD平板与G418平板筛选阳性重组子,抽提毕赤酵母基因组PCR鉴定重组质粒的插入。结果显示,p PIC9K-neuritin重组质粒经测序鉴定完全正确,电转后成功插入毕赤酵母基因组中。由此可知,成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

麻疯树逆境蛋白(curcin 2)基因的原核表达

将编码麻疯树逆境蛋白curcin 2成熟蛋白的M片段和编码前体蛋白的P片段分别定向克隆到质粒载体pQE-30、pQE-31后,获得重组质粒pQE-30-M、pQE-31-P.该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株,经IPTG诱导后M片段表达的蛋白质主要以包涵体形式存在,蛋白质的表达量与IPTG浓度及诱导时间有关.重组蛋白可与RGS-His抗体及curcin抗体分别发生专一性抗原抗体反应并被His TrapTMHP柱亲和纯化.体外抗真菌活性实验表明,复性处理后的curcin 2融合蛋白使玉米弯胞杆菌[Curvul     

人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。     

赤红球菌JDM312环己酮单加氧酶的原核表达及检测

通过酶切法从重组质粒pUC18-chnB中得到编码环己酮单加氧酶的chnB基因序列,将其定向插入原核表达载体pQE30中,构建重组质粒pQE30-chnB,转化到大肠杆菌BL21中并诱导表达目的蛋白,用SDS-PAGE电泳检测表达产物.测序结果表明chnB基因大小为1 623bp,编码由540个氨基酸残基构成的多肽.S...     

四川S.suis2强毒株溶血素样蛋白HLP序列信息分析及克隆表达产物活性检测

对四川猪链球菌2型(S.suis 2)强毒株05ZYH33溶血素样蛋白(hemolysin-like protein,HLP)编码基因hlp进行序列信息分析、分子克隆表达及溶血活性检测,深入探讨HLP的致病机制.用Blast和Clustal X程序对HLP进行基因同源性分析,用Signal P 4.1和TMHMM Server 2.0分析HLP氨基酸序列.设计合成hlp引物进行PCR扩增,先后将hlp克隆入p MD-18T载体和p ET30a表达载体中,构建p ET30a::hly原核表达质粒.将重组质粒转化至E.coli BL21中诱导表达,并对重组HLP蛋白进行纯化和溶血活性检测.同源性分析表明HLP与多种具有溶血活性的蛋白相似性较高.氨基酸序列分析发现HLP具有信号肽和跨膜区,且由DUF21、CBS和Cor CHly C 3部分组成.序列测定显示hly片段全长1 335 bp,编码445个氨基酸.重组质粒经诱导表达和纯化后电泳显示,HLP分子量约为70 k Da,具有溶血活性.结果表明,HLP是一个膜结合蛋白,不同于能够分泌到细胞外的溶血素Suilysin.重组HLP具有一定的溶血效价,此可能与致病相关.     

磷酸乙醇胺转移酶MCR1结构与功能的研究

本实验克隆了来源于E.coli的MCR1基因酶催化结构域,以E.coli表达系统表达蛋白.采用亲和层析、阴离子交换层析、分子筛层析等纯化方法获得纯度高、均一性好的蛋白;采用座滴和悬滴法,获得酶催化区域的蛋白质晶体;收集X射线数据后,分子置换法解析出酶催化区域的结构,其分辨率达到1.63埃.反常散射信号检测到4个锌离子信号,结构分析锌离子与周围Thr285、His465、His466、His395位氨基酸联系紧密,且Thr285被磷酸化.Thr285、His465、His466和His395点突变为丙氨酸后,宿主菌粘菌素抗性显著降低,表明该区域与酶活密切相关.本实验解析出MCR1酶活性区域的结构,鉴定出酶活性中心,为寻找抗MCR1靶向药物提供可用信息.     

Expression and characterization of HGV E2 cDNA inPichia pastoris

A 559 base pair fragment of cDNA locating at the putative E2 region of GBV-C/HGV was inserted intoPichia pastoris expression vector pPIC9K in the reading frame of α-factor secreting signal peptide. The recombinant expression plasmid pPIC9K-E2 was introduced intoP. pastoris GS 115 with electroporation and recombined with the host genome by homological recombination. The His⁺Mut⁺ recombinant yeasts were selected and cultivated in the BMMY medium. After 3 days induction with 0.5% methanol, the target protein (E2) accumulated up to 30% of total proteins in the supernatant. The expressed E2 protein was proved possessing antigenicity and high specificity with Western blot and ELISA probed with sera from the immunized rabbits and the patients infected by GBV-C/HGV. Biography: Wang Zhuo-hua (1977-), female, Master, research direction: genetic engineering pharmaceuticals.     

小鼠LEAP-2基因的克隆及其真核表达质粒的构建

从小鼠肝中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法,获得了mLEAP-2基因编码区的cDNA,扩增出小鼠肝表达抗菌肽-2（mLEAP-2）成熟肽基因片段,重组入克隆载体pUCm-T,经DNA测序,该基因为120 bp,编码40个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建成表达载体pPIC9-LEAP-2。重组毕赤酵母表达载体pPIC9-LEAP-2的结构,可望获得超量表达的高活性肝表达抗菌肽-2,为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定基础。     

Armillariella tabescens阿拉伯糖苷酶基因全长cDNA的克隆与表达

通过对假密环菌(Arm illariella tabescens)的表达cDNA克隆文库进行随机测序,获得一段与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列同源性很高的EST序列(AJ620046).根据获得的EST序列用SMART-RACE技术成功从假密环菌中克隆出了阿拉伯糖苷酶基因的全长cDNA,用生物信息学的方法对所获的序列进行信息学分析.分析结果显示其全长cDNA为1 016 bp,其最长的开放阅读框架为924 bp,编码307个氨基酸,该全长cDNA序列与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列具有较高同源性,80~279位氨基酸序列属于阿拉伯糖苷酶超家族,58~184位氨基酸是一个典型的结构功能域,蛋白分子质量预测为32 881 u,等电点为4.59.构建重组质粒pPIC9-AF,并在毕赤酵母菌GS115中对所获得的基因进行了表达,相对酶活达到了81.25%.     

植物Brazzein基因的合成及其克隆

根据从西非植物Pentadiplandra brazzeana Baillion果实中分离的甜蛋白Brazzein(Sra)的成熟区氨基酸序列，按照酵母密码子偏好人工合成了4对末端具粘合位点的寡聚核苷酸序列，经连接、PCR扩增后得到了179bp的Brazzein类似物的编码序列，插入到pPIC9K载体构建成重组表达载体pPIC9K-Bra．     

人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原( human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200 bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87 ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础.     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2(ChIL-2)基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建重组表达载体pPIC9K/ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母(Pichia methanolica)GS115 甲醇利用型重组表达菌株.经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 ku与14 ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质.     

新型双光子引发剂9-苄基-3，6-二［2-(吡啶-4-基)-乙烯基］咔唑的合成及其聚合特性

以咔唑和苄氯为原料，在温和条件下与N-溴代丁二酰亚胺反应得到了中间体3,6-二溴-9-苄基咔唑。从此中间体出发，经Heck反应合成了具有C_2v对称性的9-苄基-3,6-二［2-（吡啶-4-基）-乙烯基］咔唑（BPyVC）。采用核磁共振、红外、质谱等手段确定了新化合物的结构，并对化合物的光物理特性进行了评价。双光子聚合实验的结果表明，BPyVC在扫描速度为22mm/s时的双光子聚合的最低能量密度低于92.7kJ/cm²，在固定光强为12.7mW时，引发双光子聚合的最少曝光时间低于1.15ms。     

粤北大宝山酸性矿山废水氧化亚铁硫杆菌及其相关性能研究

大宝山尾矿库向下游排放的尾矿水为酸性水,其pH值低至2.5～3.5,Cd2+、Pb2+、Zn2+和SO42-等离子含量高,对下游生态会继续造成严重污染。利用9K培养基从大宝山酸性矿山废水中分离出了氧化亚铁硫杆菌,并对其生长性能作了初步研究。在分离培养过程中生成了黄钾铁矾沉淀。黄钾铁矾的生成是溶液pH值下降的主要原因。实验还表明,在pH为2.0～2.5的9K培养基培养10 d后,酸性矿山废水的Cd2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+等重金属离子含量较高,pH为3.0时降低。     

利用毕赤酵母表达植物甜蛋白（brazzein）的初步研究

实验将含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭质粒通过电导入巴斯德比赤酵母（Pichia pastori）GS115中，并从22个阳性克隆中筛选出His^＋Mut^s高拷贝转化子2个，经诱导表达，产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定，目标蛋白的相对分子量与理论值一致，又经小试（5～10L罐）蛋白产量可达385mg/L。利用大孔树脂D152初步分离，得到有微甜味的产物。进一步纯化后获得了¹D-NMR图谱。     

阿魏酸酯酶O42807在毕赤酵母GS115中的表达

研究阿魏酸酯酶O42807基因(fae)在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达及重组阿魏酸酯酶的酶学特性.化学合成fae基因序列,构建分泌型重组质粒pPIC9K-fae,经线性化后电转化至毕赤酵母GS115,对筛选出的高活性转化子进行诱导表达.SDS-PAGE分析显示:发酵上清液为单一条带,表观相对分子质量为42 ku,酶活为78.49 nkat·mL^-1,比活力为524.38 nkat·mg^-1,最适反应温度为50 ℃,在40~45 ℃温度范围内较稳定,最适反应p