造血干细胞(CD34+)表达谱数据分析

造血干细胞分化的潜能及自我更新的分子机制是造血干细胞研究中最重要的领域.通过对来自造血干细胞(CD34+)的EST(Expressed Sequence Tags)和SAGE(Serial Analysis of GeneExpression)数据进行系统生物信息学分析,发现了造血干细胞除表达大量下游分化细胞的分子标志外,还表达一些非造血组织的特异基因.在分子调控方面,反义RNA可能是一种非常重要的调控手段.     

脐血单个核细胞和CD34+细胞体外扩增造血干/祖细胞

考察了脐血单个核细胞(MNC)和CD34+富集细胞在SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo细胞因子组合下的体外扩增特性.实验发现CD34+富集细胞具有很高的扩增潜力,通过3周培养总细胞扩增了(883.2±322.4)倍,而MNC仅扩增了(53.3±6.2)倍.对比细胞集落生成和CD34+细胞的扩增发现,MNC的集落密度由最初的(270.9±54.9)CFCs/105cells上升至第7天的(1 496.3±417.7)CFCs/105cells,CD34+细胞百分比则由最初的(0.99±0.18)%上升至第7天的(4.4±1.9)%,而CD34+富集细胞在培养过程中,虽然集落总数和CD34+细胞总数始终呈上升趋势,但是其集落密度和CD34+细胞百分比则始终呈下降趋势.在两种起始细胞培养中,CFU-GM(粒细胞-巨噬细胞集落形成单位)在集落中的含量逐渐增加,BFU-E(爆式红细胞集落形成单位)含量则逐渐降低.在3周的短期培养中,MNC可以得到更多的集落形成细胞(CFC)和CD34+细胞.     

补肾和解复方对再障患者CD34+细胞造血干/祖细胞调节作用的实验研究

目的:探索补肾和解方对再障患者CD34 造血干/祖细胞的刺激增殖和诱导分化作用.方法:采用免疫磁珠法(MACS)分离纯化再障患者骨髓CD34 细胞,造血细胞半固体和液体培养体系加入不同度补和解方制剂,检测对CD34 造血干/祖细胞增殖,形成祖细胞集落的提高率,并用流式细胞仪检测液体培养后细胞表面标记的变化.结果:补肾和解复方制剂(5～100μg.mL)能提高BFU-E、CFU-E、CFU-GEMM集落产率,补肾和解复方制剂50μg/mL是液体培养刺激CD34 细胞体外增殖的最佳浓度.补肾和解复方制剂诱导细胞14天后,细胞表面表达CD334 细胞随补肾和解复方制剂的浓度升高而增加,在补肾和解复方制剂的浓度升高而增加,在补肾和解复方制剂100μg/mL时以CD15 细胞数最高,CD71 细胞和G-A 细胞数仅在50μg/mL高于未加补肾和解复方制剂的对照组.结论:补肾和解复方制剂不但能促进再障患者CD34 造血干/祖细胞的增殖,并且能诱导定向分化,具有类生长因子和协同生长因子的作用.     

微囊化基质细胞对脐带血造血干/祖细胞扩增支持

将脐带血单个核细胞与包埋有兔骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠在3种不同的培养液中进行了7d的体外静态共培养.每24h进行总有核细胞计数,在0、72和168h进行流式CD34+细胞分析以及甲基纤维素集落检验.实验结果表明:经过7d的静态共培养,在添加常规剂量造血生长因子的培养液中,总有核细胞扩增了(15±2.85)倍,CD34+细胞扩增了(5.33±0.32)倍,CFU-Cs扩增了(5.6±1.21)倍.微胶囊可以作为一种新的共培养隔离手段,微囊化兔骨髓间充质干细胞在添加适量血清或者造血生长因子组合的条件下对于脐带血造血干/祖细胞在静态下的扩增有明显的促进作用.     

浙江省脐带血造血干细胞库(湖州)启动

近日,浙江省脐带血造血干细胞库(湖州)启动仪式在湖州隆重举行,中国干细胞之父中国科学院院士吴祖泽先生与浙江省卫生厅医政处副处长张萍萍女士共同为干细胞库揭牌。2013年南太湖干细胞产业发展研讨会同时召开。诺贝尔生理学或医学奖得主马丁·伊文思爵士认为,中国干细胞技术虽然没有美国等国家开展得早,但技术水平并不落后。他表示,由他代表的英国干细胞     

小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量.     

人脐血造血干细胞在转瓶中的悬浮培养

考察经分离纯化后的人脐血CD34+富集细胞在转瓶中的扩增特性,细胞因子为SCF+IL-3+IL-6。实验发现,无论24孔板静态培养还是转瓶悬浮培养,孔板和转瓶内总细胞数分别扩增了(658.7±98.0)倍和(107.3±15.0)倍,说明CD34+具有很大的扩增潜能。对比两种培养体系下细胞集落扩增倍数发现,培养初期孔板内的集落形成能力要大于转瓶,但到培养后期,孔板内集落形成能力下降速度远大于转瓶。孔板中的CFU-GM(粒细胞-巨噬细胞集落形成单位)扩增倍数在第14天为(5.6±0.4)倍,第21天为(1.7±0.5)倍,转瓶中在第14天为(2.1±0.7)倍,第21天为(1.8±0.5)倍。对比两者的CD34+扩增情况,孔板在第14天CD34+含量达到最大值,而到第21天则大大降低,而转瓶内CD34+含量仍可保持在原第14天的水平,转瓶内的CD34+细胞的扩增也比孔板保持较长时间。     

脐血干细胞的研究与应用

脐血干细胞的基础和临床研究在最近的一、两年中获得了快速的发展,对脐血干细胞的生物学特性、采集与冻存、体外扩增及其临床使用情况进行研究有利于其更广泛地应用.     

人间充质干细胞抑制乳腺癌细胞增殖作用的实验研究

应用人间充质干细胞作用肿瘤细胞,拟揭示间充质干细胞对肿瘤细胞的作用,为今后应用人间充质干细胞进行肿瘤细胞治疗奠定理论基础.应用胎儿真皮来源的Z3间充质干细胞和胎儿骨髓来源的BMMS-03间充质干细胞的条件培养液作用于乳腺癌MCF-7细胞,观察MCF-7细胞增殖和迁移能力的变化.结果显示,应用BrdU掺入分析和流式细胞仪测定等方法发现,在间充质干细胞条件培养液的作用下,MCF-7细胞的增殖受到了明显抑制;应用划痕实验和琼脂糖滴实验发现,MCF-7细胞的迁移能力也受到明显抑制.结果表明,人间充质干细胞对乳腺癌细胞的增殖和迁移具有抑制作用.     

人脐血造血干／祖细胞体外扩增的实验研究

探索脐血造血干／祖细胞体外扩增的最佳条件;初步验证以单个核细胞作为培养起始细胞的可行性,以脐血单个核细胞作为培养起始细胞,在IMDM培养基中加入不同的因子组合培养7d,流式细胞仪测定培养前后的CD34＋细胞百分数、CD34^ CD38^-细胞百分数,分别计算单个核细胞,CD34^ 细胞和CD34^ CD38^-细胞的增长倍数,培养7d后,对照及各组合中脐血单个核细胞总数均比扩增前有十分显著的增加,但各组合相互之间扩增倍数差异不显著,CD34^ 细胞总数均比扩增前有十分显著的增加,加入SCF使扩增倍数增加更明显,未加入SCF组合中的CD34^ CD38^-细胞总数与培养前相比无明显增长,相对于对照扩增倍数也无差异;而加入SCF的组合相对于对照则有明显扩增,以上结果证实以单个核细胞作为培养的起始细胞也能达到较好的扩增效果,在本实验所用的细胞因子组合中,以SCF＋IL01＋IL－3＋IL－6＋GM－CSF＋EPO效果更佳,昆虫细胞基因工程生产的rhSCF及人尿来源的L－TPO对细胞扩增具有刺激作用,两者的协同作用明显。     

人胎儿骨髓间充质干细胞的分离及生物学鉴定

通过原代细胞培养,从引产胎儿骨髓组织中分离干细胞,然后进行生物学鉴定,旨在体外建立培养胎儿骨髓干细胞的有效方法,为进一步研究干细胞奠定基础．本研究对四个月的引产胎儿骨髓组织进行原代细胞培养,采用贴壁筛选法,在含有15％胎牛血清的L-DMEM／IMDM(1:1)混和培养液中培养,7 d后细胞可长满瓶底．显微镜下观察,细胞形态均一,呈长梭形．传代后,在8代以内的细胞贴壁能力较强,生长速度较快．将其命名为BMMS-03．在第3代时,对培养的细胞进行了于细胞标志物的生物学鉴定,采用流式细胞仪对经免疫荧光染色的细胞进行检测．结果显示:97．2％的细胞呈CD105阳性反应,66．0％的细胞呈CD106阳性反应, 9．2％的细胞呈CD34阳性反应．阴性对照组阳性反应为0．5％．生物学鉴定的初步结果提示,从胎儿骨髓组织中分离培养成功的细胞为骨髓间充质干细胞,其细胞形态学特征、CD105 、CD106 和CD34-的检测结果均符合间充质干细胞的特征．本研究成功地建立了体外培养胎儿骨髓间充质干细胞的有效方法,所获得的间充质干细胞纯度较高,增殖较快,适用于干细胞生物学和组织工程学的研究．     

影响脐血造血细胞体外培养与检测的因素

考察了分离方法、血浆（血清）、渗透压、细胞因子的保存等因素对脐血造血细胞体外培养和检测的影响。结果表明,用明胶沉降加密度梯度离心分离两步法分离比传统方法能分离到更多的单个核细胞;混合脐血血浆比胎牛血清更能支持造血细胞的生长;高渗透压对集落形成有一定影响,而低渗透压对集落形成更为有害;在３７℃下保存细胞因子,其生物活性下降最快,－３０℃冷冻保藏较好地保持其活性,解冻次数对生物活性影响不显著。     

人胚胎骨髓基质干细胞的长期培养及体外成骨特性

研究了人胚胎骨髓基质干细胞(hBMSCs)在体外长期培养时的基本特性和向成骨细胞的分化能力。结果表明：前三代hBMSCs多数呈长梭形,生长快速,增殖能力强;而后几代细胞变得比较扁平,生长缓慢,增殖能力下降;至第六代,细胞已失去增殖能力。每一代细胞生长均分为延滞期、对数生长期和稳定期,延滞期一般为6～7d,对数生长期为4～5d,最后是稳定期。前三代细胞对数生长期的群体倍增时间(PD71)基本相同,而第四代细胞的PDT略有上升,第五代细胞的PDT最大。在体外扩增能力方面,前三代细胞均可以扩增18倍左右,而第四、第五代细胞则下降至11倍、5倍。实验结果表明扩增后的细胞经过诱导可以形成钙化小结,与未诱导细胞相比碱性磷酸脂酶(ALP)活性显著提高。