siRNA沉默DNA甲基化转移酶1基因干扰胎牛成纤维细胞增殖和凋亡（英文）

为阐明Dnmt1-siRNA对胎牛成纤维细胞(FBFCs)的影响,设计了3种针对Dnmt1的siRNA来转染FBFCs.结果显示:Dnmt1-siRNA3转染FBFCs 24,48,72 h后,Dnmt1 mRNA表达水平显著降低(P0.01).在转染后48 h,siRNA3对Dnmt1抑制效率达到近80%,Dnmt1-siRNA3处理的FBFCs增殖也受到显著影响,FBFC细胞活力下降、处于G0/G1过渡期细胞数量增多(P0.05).但Dnmt1-siRNA3组FBFC细胞的凋亡率也显著增加(P0.05).说明通过Dnmt1特异性siRNA能够有效地敲低FBFC中的Dnmt1 mRNA表达量,由于细胞周期分布变化,siRNA处理后FBFC作为核供体能提高SCNT的效率.     

磷硫代siRNA的抗肿瘤基因沉默活性研究

由于目前尚无高效合成立体特异性磷硫代siRNAs(PS-siRNAs)的化学体系,本研究针对潜在的癌症治疗靶点PLK1,用a-磷硫代三磷酸腺苷(ATPaS)、a-磷硫代三磷酸胞苷(CTPaS)和a-磷硫代三磷酸尿苷(UTPaS)通过T7RNA聚合酶转录合成了部分磷硫代修饰的Rp-磷硫代siRNAs(Rp-PS-siRNAs),探究了nat-siRNAs和PS-siRNAs血清稳定性和基因沉默活性的差异性。发现酶促合成的磷硫代siRNA几乎不影响siRNA的基因沉默效率,但却显著提高siRNA的血清稳定性。因此,酶促转录合成的Rp-PS-siRNA可望作为siRNA的修饰形式,以延长siRNA的生物活性半衰期,使siRNA广泛应用于生物医学临床研究领域。     

JcERF1基因RNA干扰载体的构建、转化及沉默效果研究

构建了麻疯树(Jatropha curcas)一个新的ERF类转录因子基因RNA干扰(RNAi)载体,并将之转入过表达JcERF1基因烟草体内, 得到了RNA干扰型烟草. 利用实时荧光定量PCR(QPCR)检测了JcERF1基因的表达量, 发现该基因在干扰型烟草中表达量明显降低. 通过野生型、过表达型和干扰型烟草的种子萌发实验和高盐胁迫实验发现: 与过表达型烟草相比, 干扰型烟草的抗盐能力明显降低, 且干扰型烟草的游离脯氨酸和可溶性糖含量在高盐处理后上升的幅度明显低于过表达型烟草. 以上研究结果说明JcERF1基因在干扰型烟草体内已被有效沉默, 同时说明该基因具有提高转基因烟草抗盐性的功能.     

磷硫代siRNA的YAP基因沉默活性研究

为了探究RNA聚合酶酶促合成非对映体纯PS-siRNA（pPS-siRNA）的基因沉默活性,本研究针对潜在的癌症治疗靶点Yes相关蛋白（YAP）,通过qPCR、Western blot等方法研究了其对YAP基因的沉默效果和对HeLa细胞的细胞毒性. 结果表明,与未修饰的siRNA（PO-siRNA）相比,pPS-siRNA可以更好地下调YAP基因表达（效率提高约30％）,而没有明显的细胞毒性. 此外,MTT细胞增殖实验与流式细胞术的结果表明,经pPS-siRNA敲降YAP后,HeLa细胞的增殖受到了抑制. 说明pPS-siRNA在基因治疗方面具有优越性以及YAP作为肿瘤治疗靶点的潜力.     

KLF4沉默与阿霉素诱导的DNA损伤协同抑制肝癌HepG2细胞的生长

探究KLF4沉默与经不同作用浓度阿霉素处理诱导的DNA损伤对肝癌HepG2细胞增殖凋亡的影响及其作用机制.应用RNA干扰技术,采用siRNA转染HepG2细胞以沉默KLF4基因.采用MTT法检测KLF4沉默前后对HepG2细胞增殖的影响,使用流式细胞术检测KLF4沉默前后对HepG2细胞周期变化影响,应用Western blot法检测转染前后HepG2细胞中KLF4蛋白及细胞周期相关蛋白表达变化.Western blot检测到高浓度的阿霉素促进KLF4的表达,并且低浓度的阿霉素可使得细胞停滞在G2/M期,高浓度的阿霉素则使部分细胞凋亡(19.31%).将KLF4沉默后,发现细胞生长变缓,低浓度的阿霉素处理后,细胞随时间增加而出现更多的细胞凋亡;高浓度的阿霉素处理后,细胞数明显减少,更多的细胞发生凋亡(28.89%),且在KLF4沉默前后均发现低浓度阿霉素促进p53与p21表达,高浓度阿霉素抑制其表达.阿霉素诱导的DNA损伤可提高KLF4的表达,KLF4依赖于DNA损伤激活的p53促进p21的表达,进而引起G1/S期细胞周期阻滞.沉默KLF4与阿霉素诱导的DNA损伤可协同抑制肝癌细胞的增殖、促进凋亡,其在肝癌细胞 HepG2中扮演十分重要的角色.     

RNA干扰沉默PID1基因在C2C12细胞中表达的研究

 构建和筛选对PID1（phosphotyrosine interaction domain containing 1, PID1）基因有RNA干扰作用的PID1-shRNA表达载体。据小鼠PID1 cDNA序列,优化设计了4条shRNA及1条阴性干扰序列,插入pGPU6/GFP/Neo载体中,得到pGPU6/GFP/Neo-PID1-1、pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3、pGPU6/GFP/Neo PID1 4和pGPU6/GFP/Neo-PID1-NC。干扰载体转染C2C12细胞,以RT-PCR和Western blot技术检测shRNA对C2C12细胞中PID1 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果表明：靶向PID1基因的4个shRNA重组质粒载体经测序分析,其shRNA编码序列与预期设计的完全一致,经酶切鉴定和测序分析证实,靶向PID1基因的shRNA重组质粒载体构建成功。进一步将构建的4个表达载体分别转染C2C12细胞,24h后细胞中PID1基因mRNA表达水平依次下调 (23.58±1.87)%、(75.44±0.77)%、(70.52±0.41)% 和 (56.60±3.13)%。48 h后细胞中PID1蛋白表达水平依次降低 (30.15±5.05)%、(71.86±4.85)%、(67.93±2.28)% 和 (56.81±2.01)%。所筛选出的pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3和pGPU6/GFP/Neo-PID1-4三个表达载体均能高效地抑制转染细胞PID1 mRNA和蛋白的表达,为进一步研究PID1基因的功能奠定了基础。     

在Hep G2细胞中利用siRNA沉默GFP基因的实验探讨

目的:通过探讨小分子双链RNA(siRNA)通过RNA干扰(RNAi)机制沉默肝癌细胞株Hep G2荧光素报告基因GFP的各项生物学指标,为进一步实验和临床研究提供依据.方法:通过体外实验,对siRNA和siRNA脂质体的稳定性和细胞毒性进行评估;通过荧光标记技术,研究不同时间siRNA脂质体的转染效率;通过荧光显微镜下观察转染细胞和RT-PCR检测靶基因mRNA表达,确定不同种类、形式、剂量的siRNA对靶基因的沉默效能.结果:在空白培养液中,siRNA和siRNA脂质体可稳定至4h,在5%血清中2～4h后明显降解;100nM的siRNA和siRNA脂质体无明显细胞毒性;siRNA脂质体转染细胞株的效率随时间不同而不同,4h可达90%;非特异性siRNA/脂质体无沉默靶基因表达作用,特异性siRNA/脂质体对靶基因的沉默作用在一定范围内随剂量升高(20nM、50nM、100nM)而升高.结论:siRNA的稳定性可满足实验需要,且无明显细胞毒性,特异性siRNA转染肝癌细胞株能有效抑制靶基因表达,用脂质体转染可提高转染效率.siRNA通过RNAi机制沉默靶基因表达,为肿瘤的治疗和基础研究提供了新的工具和思路.     

大鼠CRMP1基因siRNA的筛选

目的:筛选有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列.方法:化学合成3对针对大鼠CRMP1基因的特异性siRNA,用脂质转染胺(lipofectamine)LTX转染大鼠海马神经元,通过流式细胞仪检测转染效率,使用RT-PCR与实时 PCR检测CRMP1基因mRNA的表达,从而筛选抑制效率最高的siRNA.结果:流式细胞仪检测转染效率为52.5%.通过RT-PCR的初步检测和实时 PCR的定量检测结果显示,与对照组相比,所设计的3对siRNA均能不同程度抑制CRMP1基因mRNA的表达,其中CRMP1-249 siRNA抑制效果最佳,抑制率达84.3%.结论:成功筛选出1对能有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列.     

LncRNA SIL沉默促进A549细胞增殖和迁移

研究了lncRNA SIL与肺纤维化中肺泡上皮细胞的增殖和迁移之间的关系.设计小干扰RNA沉默内源性lncRNA SIL的表达,通过RT-PCR、MTT、Western blot、细胞损伤修复实验及Transwell实验研究沉默后细胞的增殖和迁移变化.MTT结果显示:沉默lncRNA SIL后细胞的增殖能力与对照组相比...     

TGFβ1shRNA靶向抑制离体胎鼠肺成纤维细胞TGFfβ1基因表达

目的:探讨自行设计的TGFβ1shRNA对离体胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1基因表达的干扰作用,为研究纤维化病变的基因治疗提供技术基础和依据.方法:原代培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型.针对大鼠TGFβ1基因mRNA序列,设计、合成携带3条TGFβ1shRNA绿色荧光蛋白融合表达质粒载体,并设阴性质粒组和空白组为对照,通过JetPEI包裹分别转染上述高氧损伤的胎鼠肺成纤维细胞.转染后24、48和72 h收集细胞,在荧光显微镜下观察干扰效果,采用实时荧光定量PCR检测TGFβ1基因表达情况,并计算干扰效率.结果:①成功培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型;②荧光显微镜下观察,可见转染后24、48和72 h TG-Fβ1shRNA质粒组细胞绿色荧光强度均明显弱于阴性质粒组细胞,空质粒载体组未产生绿色荧光;荧光定量PCR检测转染后胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1 mRNA表达量,转染后24、48和72 hTGFβ1shRNA质粒组TGFβ1 mRNA表达量均显著低于阴性质粒组(P<0.01),其基因干扰效率则依次递减,分别为97.3%、96.9%和71.7%.结论:本研究证明自行设计的TGFβ1shRNA转染胎鼠肺成纤维细胞后24、48和72 h均能够高效干扰TGFβ1基因的表达,其基因干扰效率呈现一定的时间依赖性.     

橙皮苷对人食管癌Eca9706细胞增殖的抑制研究

本文通过MTT法和流式细胞术研究橙皮苷对人食管癌Eca9706细胞增殖的抑制作用及对细胞周期和凋亡的影响,结果显示:不同浓度橙皮苷能有效抑制Eca9706细胞增殖,且呈剂量依赖性(P<0.01),IC50为84μg/mL;22、43、84μg/mL的橙皮苷作用于Eca9706细胞48h,细胞周期在S期的比例分别为25.16%、30.13%、31.05%,比对照组明显升高(P<0.002);细胞凋亡率分别为6.23%、8.19%、10.62%,与对照组相比细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05).以上结果说明,橙皮苷通过干预细胞周期和凋亡抑制食管癌Eca9706细胞增殖.     

细胞周期调控人神经母细胞瘤细胞辐射耐受性研究

为研究脑中肿瘤对辐射的敏感性,选择SH-SY5Y神经母细胞瘤为研究对象进行辐射,并对细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期进行研究.采用γ-射线辐射,剂量分别为5,10及20 GY,通过细胞计数的实验方法,比较不同剂量辐射后的神经母细胞瘤细胞数目与不辐射细胞数目的差别,进而说明细胞的增殖情况;同时通过PI单染的实验方法比较细胞周期的不同;最后通过对凋亡蛋白caspase 3/7及caspase 8的活性进行测定比较辐射后凋亡的变化水平.发现在10及20 GY的辐射剂量辐射后,24 h时间点细胞的数量相比于5 GY及对照细胞发生了细胞数目的减少,说明在此剂量下细胞出现了死亡或细胞周期发生了明显的阻滞现象.对细胞周期的检测结果发现,5 GY细胞周期变化不明显,而10及20 GY的剂量辐射后细胞发生明显的阻滞现象.并且凋亡蛋白caspase 3/7及caspase 8蛋白活性随剂量的增加,时间点的延长而呈增加的趋势.研究结果表明,细胞辐射后存在细胞周期阻滞现象,且辐射剂量越大,细胞周期阻滞能力越强;伴随周期阻滞的缓解可出现细胞凋亡活性增加的趋势.     

RNA干涉抑制存活素表达并诱导HeLa S3细胞凋亡的研究

选择3个靶向存活素（S1,S2,S3）Survivin基因的siRNA序列,构建相应的RNA干涉载体pTet-U6-S1,pTet-U6-S2,pTet-U6-S3,将它们分别转染HeLa S3细胞,采用RT-PCR和Western印迹检测分析转染对HeLa S3细胞内源Survivin表达的影响,结果表明,针对Survivin 3’端非编码区序列的干涉载体pTet-U6-S3转染细胞后,Survivin的mRNA水平和蛋白水平均明显下调,抑制水平高于S1序列.与对照相比,S1,S2和S3片段对Survivin mRNA的抑制率分别是20%,12.5%和40%,对Survivin蛋白的抑制率分别是39.2%,17.0%和58.6%. 流式细胞术检测结果表明,抑制Survivin表达后,HeLa S3细胞凋亡比例显著提高.     

右旋一叶萩碱对小鼠黑色素瘤B16增殖及细胞周期的影响

目的:探讨右旋一叶萩碱对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖和细胞周期的影响及其作用机制。方法:右旋一叶萩碱作用于小鼠黑色素瘤细胞B16,MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期。结果:右旋一叶萩碱以时间和浓度依赖的方式抑制B16细胞生长;药物作用72 h IC50为63.34μmol/L;右旋一叶萩碱诱导B16细胞凋亡并显著减少S期、G2/M期细胞。结论:右旋一叶萩碱可以抑制黑色素瘤细胞的恶性增殖,其作用机制与诱导细胞凋亡、减少S期和G2/M期细胞有关。     

蛇床子素对人乳腺癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

蛇床子素是从传统的中药蛇床子的果实中提取的香豆素类衍生物.在发达国家以及发展中国家,乳腺癌是发病率和致死率较高的女性肿瘤之一.本研究的目的是调查蛇床子素对人乳腺癌细胞的增殖、细胞周期以及凋亡的影响.蛇床子素的抗细胞增殖活性用MTF法测定.细胞周期的分布以及细胞凋亡用流式细胞术测定.本研究结果表明,蛇床子素对抑制乳腺癌细胞的增殖、促进G1期阻滞以及诱导细胞凋亡有明显作用.该结果提示有必要进一步研究和评估蛇床子素在乳腺癌治疗中的作用.     

桑叶对乳腺癌肿瘤血管内皮细胞抑制作用的研究

本文通过流式细胞仪(FCM)和酶联免疫吸附法(ELISA)来研究桑叶对乳腺癌肿瘤血管内皮细胞(ECs)细胞凋亡、细胞周期及内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)的影响.FCM分析表明,桑叶中有效成分能够诱导异常增殖的内皮细胞凋亡,使细胞周期停滞在DNA合成期,有效阻止内皮细胞的有丝分裂(P0.05);ELISA法结果表明,VEGFR-2的表达受到明显的抑制(P0.05).以上结果证实桑叶能够有效促进乳腺癌肿瘤血管内皮细胞的凋亡、影响其细胞周期的分布、抑制乳腺癌肿瘤血管内皮细胞生长因子受体-2的表达,对其增殖具有抑制作用.     

去甲斑蝥素对人乳腺癌细胞MCF-7的杀伤效应及其可能机制

用１０μｇ／ｍＬ去甲斑蝥素（ＮＣＴＤ）作用于人乳腺癌细胞,以ＭＴＴ法、流式细胞仪、台盼蓝排斥法和透射电镜等方法分别观察ＮＣＴＤ对癌细胞的增殖抑制作用及对细胞周期和细胞凋亡的影响。结果表明：ＮＣＴＤ对乳腺癌细胞的杀伤作用有时间和剂量依赖性,药物作用２４ｈ后,Ｇ１期细胞减少,Ｇ２＋Ｍ期细胞明显增多,凋亡细胞百分比升高并可见到凋亡细胞的形态学变化。     

细胞周期与细胞凋亡共同的调控分子--Survivin蛋白(综述)

细胞周期与细胞凋亡是有着紧密联系的生命活动。尽管凋亡调控蛋白常常牵涉到细胞周期的调控,但是细胞周期与细胞凋亡共同的的调控分子却很少见。一个新的抗凋亡蛋白——Survivin蛋白,最近被发现同时具有调控细胞凋亡和细胞周期的双重功能,这为细胞周期与细胞凋亡之间存在紧密联系提供了有力的证据。另一方面,它的表达和分布特点对细胞增殖非常有利,提示Survivin蛋白可能是快速增殖细胞(如癌细胞)重要的测控分子。     

钙调素在细胞增殖中的调节作用

钙调素通过促进细胞周期的进程，实现其对细胞增殖的调节。