利用番茄U3snRNA基因上游启动区构建植物表达载体及对烟草的转化

利用番茄U3snRNA基因上游启动区和ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因DNA片段,构建含U3snRNA基因上游启动区-ACC合成酶的反义RNA-核酶嵌合序列的表达载体,重组于植物双元表达载体pGA643中,得到pGU3R.用三亲融合法导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化烟草,诱导再生小植株,获得了卡那霉素的抗性植株.提取抗性植株总DNA,通过PCR、PCRSouthern杂交检测并分别用启动区序列和ACC合成酶的反义RNA-核酶嵌合序列作探针,通过Southern杂交检测,已筛选出整合有外源基因的转化植株.为进一步研究U3snRNA上游启动区增强反义RNA-核酶基因的表达奠定了基础.     

利用人内皮抑素基因构建植物表达载体及对烟草的遗传转化

将人内皮抑素(endostatin)基因重组于植物双元表达载体pGA 643,得到重组质粒pGE.用三亲融合法将其导入农杆菌LBA 4404中,采用叶盘法转化烟草,经诱导与筛选,获得了卡那霉素抗性植株.提取抗性植株总DNA,通过PCR扩增和Sou thern杂交检测,筛选出了整合有外源基因的转化植株.为进一步研究人内皮抑素在烟草中的表达及生物学功能奠定了基础.     

丙型肝炎病毒E2基因在转基因番茄植株中的表达

以T-E1E2为模板扩增得到丙型肝炎病毒包膜蛋白基因E2,构建该基因的植物表达载体p35s-E2．通过农杆菌介导的叶盘法转化番茄子叶．转基因番茄植株叶片总DNA的PCR、Southern blot检测结果表明,E2基因已整合进了转基因番茄植株基因组中;RT-PCR,Western blot分析证实E2基因在转基因番茄植株叶片中表达．     

由TMV54103蛋白基因构建的转基因番茄及其对TMV的抗性

通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,将烟草花叶病毒(TMV)的54103蛋白cDNA转入番茄植物中,得到了转基因植株.这些植株抗卡那霉素,具有胭脂碱合成酶的活性.DNA的PCR扩增及Northernblot分析表明,54103蛋白基因已整合到番茄基因组上.攻毒实验表明,未转基因的对照组接种病毒2周后即出现花叶,并且随着时间的推移,花叶症状更加典型.而转基因的植物接种病毒后一直到开花结果都未见发病,即没有花叶出现.     

反义ACC合成酶基因导入番茄的研究

 采用农杆菌介导法将携带有反义ACC合成酶基因和NPT II的表达载体pKAC导入番茄栽培品种美国大红五星102、美国大红108、美国大红王、大红II号等中.经过卡那霉素筛选后,获得了一批抗性苗,其中有3株PCR检测为阳性.实验证明,不同激素配比对番茄子叶不定芽的诱导有一定影响,适宜的农杆菌侵染时间和浓度是番茄基因转化成功与否的关键,延迟选择有利于番茄基因转化细胞的生长.     

纳豆激酶基因导入番茄的研究

将来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶(nattokinase,NK)基因转化到人类可以直接食用的,又非常喜爱的蔬菜—番茄中,得到在转录水平表达的转基因植株.通过根癌农杆菌EHA105介导,转化番茄的下胚轴,诱导愈伤组织形成及分化成幼苗,进而再生出完整植株.提取再生植株基因组DNA,通过PCR扩增检测,结果表明纳豆激酶基因已经成功整合到番茄植物基因组中.RT-PCR实验结果证明了纳豆激酶基因在转录水平上有表达.     

番茄CDT2同源基因RNA干涉载体的构建及遗传转化研究

真核生物CDT2是CUL4-DDB1 E3泛素复合体的组成部分,在细胞周期调控、DNA复制与损伤修复中起到重要作用.本研究克隆了番茄CDT2同源基因片段并构建了CDT2基因RNA干涉植物表达载体pBI121-CDT2-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株叶片内CDT2的表达量明显低于野生型植株.转基因植株叶片叶绿素含量比野生型明显升高.该研究结果揭示番茄CDT2基因的功能做出了新的尝试.     

PuFAD8基因过表达载体的构建及其在番茄中的遗传转化

脂肪酸去饱和酶8(fatty acid desaturase 8,FAD8)是FAD基因家族成员，可参与催化不饱和脂肪酸的合成进而影响果实香气。为进一步研究PuFAD8基因的功能及其与番茄果实挥发性物质的关系，文章构建了模式植物番茄PuFAD8基因的过表达载体，通过农杆菌介导遗传转化、植物组织培养技术获得番茄PuFAD8基因过表达植株。结果表明，番茄PuFAD8基因过表达载体构建成功，并获得番茄过表达植株，以便进一步研究该基因的分子功能，为明确其在番茄果实成熟过程中挥发性物质的调控机制奠定了基础。     

农杆菌介导的抗病基因对番茄的遗传转化

通过农杆菌介导法将含有几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因的双价植物表达载体pBLGC转入番茄子叶外植体。经过共培养、卡那霉素筛选和分化再生,获得了23株卡那霉素抗性植株。PCR检测和Southern Blot检测结果表明,有7株呈阳性检测反应。通过病原真菌接种试验证明,有3株转基因植株表现出较强的抗病性反应。实验结果为进一步研究番茄抗病性和培育抗病番茄新品种奠定了重要基础。     

人角质细胞生长因子-1转化番茄的研究

人角质细胞生长因子在组织的损伤修复中起着重要的作用.以番茄子叶为外植体,通过根癌农杆菌介导法,将人KGF -1导入番茄中,共获得12株独立的抗性转化植株,PCR和DNA斑点杂交结果表明:KGF-1基因整合入番茄基因组中,为获得植物源表达的KGF -1蛋白打下了基础.     

用聚合酶链式反应扩增抗冻肽基因并在双元表达载体中克隆

抗冻肽基因导入植物的第一步合成了５＇－末端分别带有限制性酶ｘｂａＩ和ＫｐｎＩ识别位点的一对引物，以美洲拟鲽抗冻肽的ｃＤＮＡ克隆为模板，用锚定聚合酰酶链反应扩增了抗冻肽基因，并克隆到细菌表达载体ｐＧＥＭ３２ｆ（一）和植物表达盒式载体ｐＧＡ６４３中，以限制性酶切分析和菌落杂交技术证明了转化子质粒ＤＮＡ中的含有抗冻肽基因，又用ＰＣＲ方法扩增了转化子的抗冻肽基因，从而证实了克隆成功。     

大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因的测序及对烟草的转化

对利用聚合酶链式反应所克隆的大肠杆菌ｂｅｔＢ基因进行了序列测定,结果证实获得了该基因的克隆ｐＸＹ０１,ｐＸＹ０５以及亚克隆ｐＸＹ１１。将该基因置于ＣａＭＶ３５Ｓ启动子调控下,导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４中,叶盘法转化烟草,在含卡那霉素的选择培养基上筛选抗性芽,并进一步诱导小植株的再生。利用ＰＣＲ技术检测基因整合到烟草基因组中。     

棒状杆菌表达载体pJL23的构建

质粒ｐＧＡ４６－４带有从谷氨酸棒杆菌染色体上分离到的有启动功能的片段,用ＰＣＲ技术从ｐＧＡ４６－４中扩增了该片段的关键区域;启动子ＰＧＬ,将该启动子经ＥｃｏＲⅠ－ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后,与大肠杆菌质粒ｐＪＬ０１的ＥｃｏＲⅠ－ＢａｍＨⅠ大片段连接,再接入Ｘｙｌ Ｅ ｇｅｎｅ和棒状杆菌质粒ｐＸＺ１０１４２,构建成棒状杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体ｐＪＬ２３。用邻苯二酚双加氧酶基因检测表明,该表达载体可在棒状     

Lat52介导的特异性表达载体的构建及其鉴定

利用含花粉特异性启动子Lat52的质粒pLat52－7、含细胞毒素A链基因的质粒pGA968以及表达质粒载体pGA987，构建了含有Lat52特异性启动子和细胞毒素A链基因的表达载体，经酶切和PCR进行鉴定，证明所构建的重组载体即为实验所需的载体质粒，从而为下一步的转化模式植物拟南芥菜打下了基础。     

以提高乙肝病毒表面抗原表达量和免疫原性为目的的番茄果实特异表达载体的构建

为了提高乙肝病毒表面抗原基因在番茄果实中的表达量和免疫原性,采用克隆的E8番茄果实特异表达启动子和乙肝病毒表面抗原M蛋白基因构建了植物表达载体pBIES2, 及只含有乙肝病毒表面抗原S蛋白的表达载体pBIES,并将它们分别导入根癌农杆菌LBA4404中.最后对该载体的优越性进行了讨论.     

番茄黄化曲叶病毒病抗性材料的筛选鉴定

 为评估新培育番茄栽培品种对番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）的抗性水平，更全面地了解这些品种的抗病性差异，以金棚1 号和金曼为感病对照，采用带毒烟粉虱自然传毒方式，对各品种的发病时间、发病率及病情指数等参数进行比较，结合PCR 及ELISA 对TYLCV 的检测结果，综合分析了18 个番茄品种对番茄黄化曲叶病毒的抗病性。结果表明，不同品种对TYLCV 的抗性差异较大。金棚1 号和金曼两份材料发病率都达到100%，病情指数在65.2 以上，属于典型的感病品种；秋光15-6、PC-88 和秋光69 号3 份材料发病率和病情指数均为0，属于抗性较高的品种；其他13 份材料的发病率和病情指数分别在5.6％～45.2%和2.6～18.0 之间，分别表现了不同程度的抗、耐病水平。     

高效液相色谱检测番茄与土壤中的吩胺霉素残留

吩胺霉素是我国具有自主知识产权的新型抗生素类杀菌剂.选取番茄及三类理化性质不同的土壤为研究对象,建立了吩胺霉素在上述基质中的液相色谱检测方法.土壤中吩胺霉素选择混合液(V_(氨水)∶V_(乙醇)∶V_(二氯甲烷)=1∶2∶3)振荡提取,番茄中吩胺霉素采用乙腈振荡提取,碱性氧化铝柱净化.土壤与番茄中的平均回收率分别为80.2%~95.7%和80.1%~85.6%,RSD(相对标准偏差)分别为2.14%~4.17%和4.12%~5.17%.吩胺霉素的最小检出量为0.2ng,在基质中最低检测限为0.01mg/kg.本方法简单可靠,基质效应弱,符合农药残留分析要求,可用于土壤和番茄中吩胺霉素的残留检测.     

番茄八氢番茄红素合成酶基因的克隆及超量表达载体构建

八氢番茄红素合成酶是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄该酶的编码基因序列设计一对引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1500 bp的全长cDNA片段.测序结果表明,此片段包含一个长为1239 bp的完整的编码框,其氨基酸序列与辣椒、向日葵、万寿菊、枸杞、番木瓜、温州蜜柑、拟南芥八氢番茄红素合成酶基因编码的氨基酸序列的一致率分别为88%、75%、75%、74%、73%、73%、7l%.对这个全长片段构建了超量表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体.