嗜铬粒蛋白N区抗真菌活性片段研究

为寻找高效低毒的抗真菌药物,利用PCR技术扩增了编码人嗜铬粒蛋白N端18-76、18-66和31-76位氨基酸(CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76)的DNA片段,将之克隆进枯草杆菌诱导型表达载体pSBPTQ,获得3种重组质粒pSC18-76、pSC18-66和pSC31-76,转化枯草杆菌DB1342。SDS-PAGE分析结果显示:经蔗糖诱导后,CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76片段分别在枯草杆菌工程菌中获得表达,产物分泌到细胞外。表达量分别为5.6 mg/L、5.3 mg/L和5.6 mg/L。利用孔穴琼脂扩散法检测表达产物的抗真菌活性,并与CGA1-76进行比较,发现CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76对烟曲霉菌、黄曲霉菌、石膏样小孢子菌和白念珠菌均有抑制作用,并以CGA31-76对白念珠菌的抑制作用为最强,CGA18-66对除白念珠菌之外的另3种测试真菌的抑制作用较强,而CGA18-76对测试真菌的抑制作用最弱。     

嗜铬粒蛋白N端衍生肽段的表达及其抗菌活性分析

通过基因工程方法表达了重组CGA1-76、CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76,并利用孔穴琼脂扩散法检测对大肠杆菌和枯草杆菌的抑制作用。结果表明:CGA N端片段对枯草杆菌和大肠杆菌表现出不同的抑制作用;CGA1-76抑菌作用最强,抑菌圈直径达到22mm,而CGA18-66和CGA31-76的抑菌圈直径不到CGA1-76的一半,CGA18-66没有抑菌圈。因此,推测CGA抗细菌活性中心可能在CGA N端1~17个氨基酸区域。     

枯草杆菌诱导型高效表达-分泌系统的构建

利用枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株,sacB诱导基因及degQ,degU(Hy)正调控基因构建了诱导型表达-分泌系统以解决枯草杆菌分泌大量胞外蛋白酶和外源基因表达水平不高的问题.采用共转化方法将枯草杆菌IA95的degU(Hy)突变引入枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株DB403,获得degU(Hy)和蛋白酶三缺陷的新菌株DB1342;利用sacB基因的启动子--信号序列及芽孢杆菌的两个正调控基因degQ和degU(Hy)构建了诱导型表达-分泌载体pURT3及pURTQ4,由DB1342突变株及pURT3及pURTQ4载体组成枯草杆菌诱导型高效表达和分泌系统.在本系统中内源基因sacB的表达量是原菌株DB403的296倍,将地衣杆菌α-淀粉酶基因引入本系统后在sacB,degQ,degU的调控和蔗糖的诱导下,α-淀粉酶的表达量是在DB403中的140倍,证实degQ及degU对基因表达的增强作用是叠加的.     

β-内酰胺酶基因在谷氨酸产生菌T_6-13染色体上的整合与表达

以质粒pUC13编码的β-内酰胺酶基因为外源基因,通过随机连接谷氨酸产生菌T_6-13染色体DNA片段后转化T_6-13原生质体,使其整合到染色体上,得以表达.在实验条件下,所测19株转化子的抗性都有很高的稳定性,其中10株能百分之百地保持抗性.经生物素标记的pUC13为探针的分子杂交实验证实抗性基因已整合到T_6-13菌染色体DNA上。     

血小板生成素在枯草杆菌中的表达分泌及前肽作用

利用PCR方法扩增得到枯草杆菌本身的表达调控序列SP（含有信号肽）和Pro序列（包含信号肽和前肽），分别与血小板生成素(TPO)结构基因及枯草杆菌载体片段连接，构建两个重组TPO枯草杆菌表达载体，转化受体菌，得到DB403（SP-TPO）和DB403（Pro-TPO）重组克隆，比较有无前肽对其表达分泌的作用.用ELISA和Western Blot检测TPO的表达分泌，发现DB403（Pro-TPO）能够表达分泌TPO，而DB403（SP-TPO）未发现TPO的分泌.对小鼠腹腔注射DB403（Pro-TPO）发酵浓缩液，发现能够明显增加血小板数目，与自身对照相比增加84.2％，与生理盐水对照比较增加99.7％.以上实验说明Pro-TPO能够表达分泌有明显活性的TPO蛋白，而且前肽对外源蛋白的分泌是必要的.     

利用加强型绿色荧光蛋白标记黄色单胞菌的研究

通过连接T载体与来自质粒pSEBG上的egfp基因而构建成质粒pZTE,并将质粒pZTE的egfp基因插入到自杀质粒pTnMod-OGm转座子上的多克隆位点Kpn I和Sal I中构建成质粒pTE-OGm,最后pTE-OGm的egfp基因转座子元件通过转座作用插入到受体菌黄色单胞菌L1的染色体中,从而使黄色单胞菌L1获得较稳定的绿色荧光标记,为进一步在MBR反应器中更好地示踪黄色单胞菌L1的生长和迁移情况奠定了基础。     

人Endostatin基因的克隆及其在Hela细胞中的表达

利用RT-PCR克隆人Endostatin基因,分别构建到双顺反子表达载体pIRES2-EGFP和融合表达载体pEGFP-C1中.两个重组表达载体利用脂质体介导转染真核细胞Hela,48 h后可在荧光显微镜下观察到被转染细胞发出绿色荧光.传代10次后,绿色荧光仍持续表达,说明是稳定转染.以转染细胞的总DNA为模板PCR检测Endostatin基因已整合到细胞染色体上.利用兔抗人Endostatin抗体对已转染细胞进行免疫组化检测,显微镜下观察,转染的细胞显棕红色,表明Endostatin在转染细胞内稳定表达.本试验通过报告基因检测,DNA检测,免疫细胞化学检测三个水平证明Endostatin已整合到细胞的染色体上,为基因治疗以及联合治疗打下基础.     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因在荧光假单胞菌中的表达

将已克隆到的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans)C-2的几丁酶基因chi1片段克隆到质粒载体pUXBF5中，得到重组质粒pUXCH1，该重组质粒在大肠杆菌中可以表达产生具有生物活性的几丁酶并分泌到胞外。将pUXCH1分别利用感受态法和三亲本杂交法转化荧光假单胞菌（Psendomonas fluorescens），在含有卡拉霉素的金氏B平板上筛得转化子。但将转化子点种于几丁质平板上却不能产生水解圈，提取细胞内容物后用比色法也没有检测到有效的酶活性。该研究表明环状芽孢杆菌 的几个酶基因chi1已经被成功的整合到荧光假单胞菌的染色体上，但却没有表达或表达效率极低，这可能是由于荧光假单胞菌的表达系统不能正确有效的识别存在于该chi1几丁酶基因片段中的环状芽孢杆菌基因启动子而造成的。     

枯草杆菌启动基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以大肠杆菌启动基因选择载体pHE5为载体,枯草杆菌染色体DNA为供体,克隆了一批启动基因功能片段,带克隆片段的重组质粒在大肠杆菌中表现不同的四环素抗性水平,其中50%在100μg/ml以上,12%达到200μg/ml。对其中一个转化子进行质粒检测和分析,获得一个重组质粒pHE273,经酶切分析证明,克隆的强启动基因位于2.2kb的EcoRI-HindⅢ片段上。     

单核细胞增多症李斯特菌InlC基因缺失株的构建与鉴定

为探讨单核细胞增生性李斯特菌(Lm)InlC基因在Lm致病性中的作用,本研究对其进行缺失。以单核细胞增多症李斯特菌4b血清型临床分离株LM-90SB2DNA为模板,扩增出用于缺失InlC基因的上、下游同源臂。运用SOE-PCR技术,将上、下游同源臂融合扩增得到△InlC基因缺失片段。将△InlC基因缺失片段与自杀性质粒p KSV-7连接,构建p KSV7-△InlC质粒。电转p KSV7-△InlC于LM-90SB2感受态细胞中,经过10μg/m L氯霉素和41℃下连续传代15代,获得单交换重组株,然后在41℃氯霉素中传至第108代,获得双交换重组株,菌液用旁侧引物进行PCR鉴定,然后30℃无氯霉素条件下连续传代培养30代丢失自杀性质粒并检测其遗传稳定性。结果显示:获得LM90SB2-△InlC缺失突变株,旁侧引物扩增只有1条1480 bp大小的片段,同时,对缺失片段进行测序验证,结果表明成功对InlC基因进行了缺失,并且缺失株遗传稳定。LM90SB2-△InlC的构建为进一步研究InlC基因在LM毒力中的作用奠定了基础。     

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达栽体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α-淀粉酶基因amy在B.subtilis DB403中的高效表达,活力达到770 U/mL.经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35.8 U/mg,纯化倍数为1.7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,重组酶AM...     

角蛋白酶基因kerB的提取、 克隆及表达

从角蛋白酶产生菌株地衣芽孢杆菌L-25中提取基因组DNA， 借助特定引物通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到kerB基因片段. 扩增后的kerB片段通过分子生物学方法克隆 到产酶缺陷型枯草芽孢杆菌DB104菌株敏感细胞中进行表达. 结果表明， 表达成功的FD-8菌 株（DB104/pLK18）可以在羽毛培养基上生长并完全水解羽毛.     

枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达

为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL.     

荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达

枯草芽孢杆菌是生物工业用的重要宿主体系。为实现荧光蛋白从分子水平定量追踪枯草芽孢杆菌培养过程的目的,构建了一系列整合型表达载体pX-GFPmut1和游离型表达载体pSW1-GFPmut1,pSW1-CFP,pSW1-YFP,研究了不同颜色荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中整合型表达和游离型表达的差异。最适合的荧光蛋白表达体系是用游离型质粒pSW1-GFPmut1在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白GFPmut1。含pSW1-GFPmut1枯草芽孢杆菌通过木糖诱导表达GFPmut1后,细胞破碎后的荧光强度和细胞浓度呈线性关系。结果表明,利用枯草芽孢杆菌表达荧光蛋白可以实现利用荧光蛋白快速定量枯草芽孢杆菌培养过程。     

荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达

枯草芽孢杆菌是生物工业用的重要宿主体系。为实现荧光蛋白从分子水平定量追踪枯草芽孢杆菌培养过程的目的,构建了一系列整合型表达载体pX-GFPmut1和游离型表达载体pSW1-GFPmut1,pSW1-CFP,pSW1-YFP,研究了不同颜色荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中整合型表达和游离型表达的差异。最适合的荧光蛋白表达体系是用游离型质粒pSW1-GFPmut1在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白GFPmut1。含pSW1-GFPmut1枯草芽孢杆菌通过木糖诱导表达GFPmut1后,细胞破碎后的荧光强度和细胞浓度呈线性关系。结果表明,利用枯草芽孢杆菌表达荧光蛋白可以实现利用荧光蛋白快速定量枯草芽孢杆菌培养过程。     

黄瓜灰霉病拮抗菌的筛选鉴定及其抑菌特性研究

从石家庄地区多个蔬菜大棚的根际土壤分离筛选到一株高效生防菌F1-2,对黄瓜灰霉病菌的抑菌圈直径高达33mm。根据菌株F1-2的形态特征、生理生化特性以及16SrDNA序列对其进行鉴定,初步确定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。采用生长速率法对拮抗菌的抑菌谱进行测定,其对所选的16种病原菌均有很好的抑制作用。实验还对拮抗菌F1-2的抑菌特性进行了研究,菌株连续传代至10代抑菌性能保持不变,菌株的发酵液对热和酸碱都比较稳定。该菌株的代谢产物具有广谱抑菌活性和较强的稳定性,具有开发成为灰霉病生防制剂的潜力。     

突变野油菜黄单胞菌α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的整合表达

用定向进化的一种新方法,对野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)的α-淀粉酶基因(XAMY)进行PCR体外诱变后获得了一个编码的酶活性提高的突变基因,将其克隆到由rDNA序列介导的酵母整合型表达载体pHBM368上,得到重组质粒pHBM368XA.将pHBM368XA转化酿酒酵母S.cerevisiae INVScⅠ,获得了整合型分泌表达α-淀粉酶的酵母重组菌株XA01.对选择的3个工程菌α-淀粉酶表达的稳定性进行了检测,结果表明在完全培养基中连续培养80代,淀粉酶的酶活性仍然保持稳定.在淀粉酶自身信号肽引导下,胞外分泌效率可达50%.     

ribR基因在产核黄素枯草芽胞杆菌中的组成型表达

枯草芽胞杆菌ribR基因编码单功能黄素激酶,催化核黄素转化为FMN.ribR基因作为ytmI-ytnM操纵子的一部分,其表达调控机制尚不清楚.用PCR方法扩增了枯草芽胞杆菌veg基因的启动子vegP,连接到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pHP13上,构建了表达型重组质粒pHP13-V.用PCR方法扩增了ribR基因,连接到pHP13-V上,构建了重组质粒pHP13-VR.将pHP13-VR转化产核黄素的枯草芽胞杆菌24A1,使ribR基因在24A1中组成型表达,得到菌株24A1/pHP13-VR.与24A1相比,24A1/pHP13-VR菌落由亮黄色变为微黄色,核黄素产量下降为1.26 mg/mL,下降了45%.结果说明,在ribC基因突变背景的过量合成核黄素枯草芽胞杆菌中,ribR基因的存在对菌株的核黄素发酵有一定的抑制作用.