一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

细菌Ⅱ型分泌途径控制产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes) S2中卵磷脂酶的分泌

从水稻根际分离筛选出1株降解卵磷脂的有机磷降解细菌菌株S2, 通过形态指标、生理生化性状、16S rDNA序列、(G+C)含量以及DNA-DNA杂交分析, 鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes). 采用双亲接合的方法将带有Tn5转座子的质粒导入产碱假单胞菌S2菌株中进行转座子插入诱变, 从5000个卡那霉素抗性的Tn5插入突变株中, 筛选到3株丧失解磷能力的突变株(M808, M1329和M1400)和1株解磷能力增强的突变株(M20). 对Tn5插入位点的基因进行DNA测序表明, 丧失解磷能力突变株中被突变的基因分别是xcpS, xcpX和xcpW, 它们分别编码XcpS, XcpX和XcpW蛋白, 这些蛋白是细菌Ⅱ型分泌途径中的主要成分. 将xcpS, xcpX和xcpW基因分别构建在pLAFR3载体上, 通过双亲接合的方式分别导入上述M808, M1329和M1400三个丧失解磷能力突变株中进行功能互补实验, 结果表明这3个基因都能使各自相对应的突变株恢复解磷能力. 以上结果表明, 在产碱假单胞菌中卵磷脂酶的分泌是通过Ⅱ型分泌途径来完成的. 解磷能力的丧失可能是由于Tn5插入xcp基因簇中的某一基因破坏了卵磷脂酶向胞外的分泌, 造成突变株不能降解有机磷. 在解磷能力增强突变株M20中, 被突变的基因与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PAO1中的chpA基因(参与细菌的颤动)同源性达88%.     

中温纤维分解真菌尖镰孢Fusarium oxysporum的一种新的耐热内切葡聚糖酶

Fusarium oxysporum L19是一株典型的中温真菌, 从其培养液中分离到一种新的耐热内切葡聚糖酶(EGt). 用传统的酶动力学方法, 以CMC-Na为底物, 30分钟的反应时间确定其最适反应温度为75℃; 热稳定性指数衰减拟合曲线显示70℃半衰期为15.1分钟; 该酶不作用于对硝基苯纤维二糖苷(pNPC）. EGt对大多数金属离子及化学试剂不敏感, N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）的蛋白质侧链修饰表明, Trp处于其活性中心. N-末端氨基酸序列为SYRVPAANGFPNPDASQEKQ, 基因测序以及广范的序列比对分析显示, EGt与已知的内切葡聚糖酶没有同源性. 这是首次从中温真菌Fusarium oxysporum中分离到耐热纤维素酶, 多种同工酶的表达可能有助于其适应复杂的生存环境.     

一株分离自新疆天池寡营养环境的糖丝菌(Saccharothrix sp PYX-6)降解芘的特性

从没有被芳烃污染的新疆天池采集的水样中分离得到一株能够以蒽、菲、芘为惟一碳源和能源的菌株, 并编号为PYX-6. 通过对其形态、生理生化特征、细胞壁组分、脂肪酸组成、DNA分子(G + C)摩尔百分含量及16S rDNA 序列同源性比较发现, 菌株PYX-6为Saccharothrix sp. 对菌株PYX-6以芘为惟一碳源生长和底物降解的研究结果表明, 0.005%酵母膏对细胞生长和芘降解具有明显的促进作用, 细胞生长和底物降解的最佳pH和摇床转速分别为pH 6~8和200 r/min, 细胞生长比底物消失稍迟. 对降解过程中间代谢产物进行质谱分析表明, 邻苯二甲酸是芘降解的中间代谢产物, 说明Saccharothrix sp PYX-6 的降解途径不同于过去报道的Mycobacterium sp PYR-1 的降解途径.     

具有高比活性的新木聚糖酶XYNB的酶学性质研究及其编码基因的克隆和表达

纯化了橄榄绿链霉菌A1产生的胞外木聚糖酶XYNB, 并对其酶学性质进行了测定. XYNB具有优良的酶学性质, 最适pH为5.2, 最适温度为60℃, 比活性高达2869.78 U/mg, 对金属离子及EDTA和SDS等具有较好的抗性. 根据木聚糖酶成熟蛋白N端氨基酸序列测序结果设计引物, 克隆了此酶的成熟蛋白编码基因xynB. 基因全长576 bp, (G+C)含量为64.3%, 编码191个氨基酸, 理论分子量为20.839 kD, 是一种新的木聚糖酶基因. 构建了xynB表达载体并在大肠杆菌中得到了表达, 表达产物具有正常的生物学活性.     

用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

α-半乳糖苷酶是进行B→O血型改造的工具酶. 采用RT-PCR方法, 从中国海南Catimor咖啡豆中克隆了全长1.1 kb的α-半乳糖苷酶cDNA, 并构建了其表达载体. 电穿孔法将载体导入毕赤酵母GS115细胞, 筛选出重组α-半乳糖苷酶菌株. 离子交换层析纯化出α-半乳糖苷酶, 酶比活性从15 U/mg 提高到28.14 U/mg. 进一步鉴定了酶的生物化学性质, 其K_m = 0.275, V_max = 0.014 mmol·L^-1·min^-1. 据此确定了B→O血型改造的条件: pH 5.5~5.6, 每毫升红细胞使用100 U α-半乳糖苷酶, 26℃, 4 h. 经动物输血实验初步证明, 酶解反应后的通用O型血(enzymatically converted group O red blood cells, ECORBC)是安全的.     

拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶AtPLC6基因的克隆与表达

利用文库筛选和RT-PCR方法, 从拟南芥中克隆到长度为1954 bp, 包括全长1734 bp编码区的AtPLC6 cDNA, 推测其编码一含有578个氨基酸的多肽, 其等电点为7.24, 分子量为66251.84 Da. 在GenBank中进行序列比对发现, AtPLC6为一新发现的拟南芥PI-PLC基因. 对推测的氨基酸序列结构的分析表明, AtPLC6具有EF手性结构、X结构域、Y结构域和C2结构域, 与植物中已知的其他磷酸肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)在结构上相似, 类似于动物中典型的δ-型磷酸肌醇特异性磷脂酶. 将AtPLC6的编码区序列插入原核表达载体后进行了原核表达, 纯化的AtPLC6重组蛋白可水解PIP2产生IP3和DAG, 且水解活性呈明显的钙依赖特性, 反应的最适Ca²⁺浓度为10 μmol/L. Northern分析结果表明, 在检测的根、茎、叶、花、果和幼苗中均有AtPLC6 mRNA的转录, 但转录水平较低. 用ABA, NaCl, 冷和热等胁迫处理的实验表明, AtPLC6 mRNA的转录受到冷胁迫的诱导, 而受ABA, NaCl和热等胁迫影响较小, 推测AtPLC6可能参与了植株对冷胁迫的响应.     

恶臭假单胞菌ND6菌株中与萘降解相关的新型水杨醛脱氢酶NahV

在大肠杆菌中表达了Pseudomonas putida ND6菌株中与萘降解有关的水杨醛脱氢酶同工酶 NahV, 并对其酶学性质进行了研究. 结果表明, NahV与ND6菌株中经典的水杨醛脱氢酶NahF的氨基酸序列同源性较低, 是一种新的水杨醛脱氢酶. 对NahV和NahF的酶动力学研究结果表明, NahF具有更高的催化效率, 而NahV对水杨醛和NAD⁺的亲和力更强. ND6菌株的NahV和NahF都有较宽的底物范围, 可以催化水杨醛、5-氯水杨醛、甲醛、间硝基苯甲醛、邻硝基苯甲醛、邻甲氧基苯甲醛、戊二醛、辛醛和乙二醛的脱氢反应, 但对不同底物的催化效率不同. Fe²⁺, Cu²⁺和Zn²⁺对NahV有激活作用, 而NahF只能被Fe²⁺激活. NahF具有更好的热稳定性, 在50℃保温30 min仍有72.8%的酶活力, 而NahV则丧失了88.8%的酶活力. DNA斑点杂交结果表明, 类nahF基因在本研究检测的两种来源的萘降解细菌中都存在, 而类nahV基因只存在于一种来源的萘降解细菌中.     

水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24 kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因. 利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合, 构建了含4892个单株的F₂定位群体. 同时, 利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库, 构建了一个覆盖目标基因位点的长约213 kb的跨叠克隆群. 根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列, 以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序, 设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位. xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离, 标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM, 物理距离约为24 kb. 对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测, 揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因. 对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

胚乳特异sbeⅡa启动子在小麦中的评价及特性分析

淀粉的合成是一个复杂的生化过程. sbeⅡa基因是淀粉合成过程中的关键酶基因之一, 在小麦籽粒成熟过程中对淀粉, 尤其对支链淀粉的生物合成调控起重要作用. 为了解sbeⅡa基因的调控机理及其胚乳特异表达特性, 利用APCR方法克隆了sbeⅡa启动子3094 bp片段, 并对该片段进行测序, 同时利用GUS瞬间表达体系对sbeⅡa启动子序列进行不同片段的功能缺失研究. 研究结果表明, 3094 bp序列(存在于sbe.g融合体中)具有稳定的启动子活性, 而5′或3′缺失体的启动子活性明显降低. 在sbeⅡa启动子中间缺失体中, 一些缺失体仅有微弱活性, 但sbe.e在缺失–1579~–1210 bp片段情况下, 却具有比sbe.g(含启动子全长序列)还要高的启动子活性. 研究初步证明, 一些固定序列(motifs), 如 –300 bp因子、G盒以及醇溶蛋白盒(Prolamin box)等作为正调控因子在决定启动子胚乳特异表达模式中是必需的, 而且在–1579~–1210 bp片段中也存在一些负调控因子或固定序列. 在瞬间表达检测体系中, 小麦胚乳组织年龄对检测结果有着重要影响.     

阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析

为研究具有广谱拮抗活性的阴沟肠杆菌B8的拮抗机理, 应用自杀性质粒pZJ25, 将Tn5转座到B8的染色体上, 筛选到2株拮抗活性丧失的菌株. 选择其中B8F突变株, 应用Tn5上的Kan^r基因作为标签, 对Tn5插入位点右侧的拮抗活性相关基因片段进行了克隆, 筛选得到质粒pTLF, 经亚克隆后测序, 获得F片段735 bp的序列. 提取原始菌株B8基因组DNA, 酶切后与PstⅠ接头连接, 应用接头引物和根据F片段设计的特异引物, 在F片段的左右两侧进行染色体步行, 获得了F片段(Tn5插入位点)左侧的1106 bp序列和F片段右侧的664 bp序列. 生物信息学分析显示, 获得的B8菌株拮抗相关基因序列包含3个ORF, 与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(基因GenBank登录号AY192157)有较高的同源性, 分别对应于admM, admN和admO共3个基因. 被Tn5插入破坏的ORF(命名为anrF基因)对应于admM (Polyketide 合酶基因), 插入位点位于终止密码前214 bp处. 由此证明, anrF基因与B8菌株的拮抗活性相关, 推测B8菌株产生的拮抗物质为andrimid.     

Mutator转座子介导的玉米插入突变体库的构建及遗传评价

以Q105, WW51, 115F, V26-2, 919J为Mutator转座子供体材料, 与本地优良玉米自交系受体材料Hz85, W328以及S-Mo17^Rf3Rf3杂交, 获得26718单株的插入诱变F₁群体(M1). 田间鉴定M1单株的生物学特征及农艺学性状的表型突变, 室内考察突变单株自交果穗M2籽粒性状的突变类型, 并以斑点籽粒出现的频率评价Mu因子的转座频率. 结果表明, 在所构建的Mu介导的玉米插入突变体库中, 以W328为母本(BzBz)的M1群体平均田间表型突变频率为0.07; 以W328 × Mu的M2果穗斑点籽粒的出现频率评价的Mu转座频率为0.121802; 在22500个S-Mo17^Rf3Rf3 × Mu单株中, 发现了5个S型玉米细胞质雄性不育突变单株, 突变频率为2.2×10^-4. 利用优化的MuTAIL-PCR技术分析了99条转座子插入位点的侧翼序列, 归并整理后获得59条(每条约400核苷酸序列)非重复靶位点序列. 对59条序列非重复的Mu因子插入产生的9 bp靶位点正向重复序列进行同源性比较分析, 结果表明, Mu的插入有序列热点. 经生物信息学分析后注释了27条与玉米、水稻等植物核苷酸数据库中匹配值较高的功能序列. 利用比较基因组学方法将36条单一基因序列定位在玉米遗传图谱上, 有多条Mu插入靶位点序列定位在单个标记位点上. 分析发现, 8条Mu插入靶位点序列的预测功能与其相应的定位标记的功能具有一致性. Mu插入突变体库的构建与遗传评价为利用Mu转座子进一步发掘玉米基因、深入开展玉米功能基因组学研究搭建起重要的技术与材料平台.     

水稻Ac/Ds系统的Ds转座行为

将玉米的转座子系统Ac/Ds导入水稻基因组中诱导产生突变体的方法已成为构建水稻插入突变体库的主要策略之一. 本研究通过水稻Ds-T-DNA转化纯合体和Ac-T-DNA转化纯合体的杂交, 构建水稻的Ac/Ds双因子转座系统, 对F₁~F₅代的Ds转座行为进行了研究. 通过转座检测, 发现1例Ds转座引起约170 bp T-DNA载体序列的缺失, 另1例Ds转座插入基因组时带有一段272 bp的T-DNA载体序列. 对F₁~F₅代Ds转座的连续检测结果表明, 配子体转座频率随世代的增加而提高, F3代的配子体转座频率达54.2%. 采用TAIL-PCR的方法扩增Ds元件旁侧的基因组序列, 对17个TAIL-PCR产物的序列进行了分析, 发现有5例Ds插入到基因序列中, Ds既可发生邻近位置的转座, 也可发生不连锁的转座, Ds在染色体间的转座频率为33.3%.     

水稻稀穗突变体的遗传分析及基因的精细定位

水稻稀穗突变体lax影响花序发育的主要特征是: 穗轴上能形成正常的一次、二次枝梗, 侧生小穗的发育被完全阻断, 只在枝梗的顶端发育形成单个小穗, 且小花呈多种异常变异. 突变体与粳稻品种W11杂交获得F₂分离群体. 以该F₂分离群体为基础, 根据水稻基因组序列设计微卫星引物和CAPS标记, 并进行连锁分析, 将稀穗基因定位在水稻第1染色体长臂的CAPS标记HB2和微卫星标记MRG4389之间, 与两标记间的距离均为0.14 cM, 与CAPS标记LZ1共分离. RT-PCR分析结果显示, 在稀穗突变体中与花器官发育相关的B功能基因OsMADS2, OsMADS4, OsMADS16 以及C功能基因OsMADS3的转录水平明显下降, 而A功能基因 RAP1A的转录水平未受到影响.     

水稻半矮秆基因sd-g的精细定位

矮秆基因的发掘、研究和利用是水稻株型改良育种和植物生长发育分子生物学研究的重要基础. 利用新桂矮双矮与02428杂交产生的F₂群体对sd-g进行了精细定位. sd-g基因首先被定位在水稻第5染色体上微卫星标记RM440和RM163之间, 遗传距离分别是0. 5和2.5 cM. 为了进一步精细定位sd-g基因, 利用已经公布的水稻基因组序列, 在sd-g基因附近区域寻找微卫星序列并发展新的标记, 在RM440和RM163之间发展了9个微卫星标记. sd-g基因被进一步定位在SSR5-1和SSR5-51之间, SSR5-1与sd-g之间距0. 1 cM, SSR5-51与sd-g之间相距0. 3 cM, 而SSR418与sd-g表现为共分离. 以此为基础, 构建覆盖sd-g基因区域的BAC重叠群, sd-g基因被定位在AC105319约85 kb的区段上, 这为sd-g基因的图位克隆奠定了基础.     

水稻花优势表达基因RA68的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻花中克隆了1个编码含丰富脯氨酸和苏氨酸结构域多肽的cDNA, 其相应的基因命名为RA68. RA68含3个外显子和2个内含子, 编码由219个氨基酸残基组成的蛋白质. 数据分析结果显示, 该蛋白由1个22个氨基酸残基组成的信号肽, 1个亲水性的N-端结构域和1个疏水性的C-端结构域组成. N-端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列. Southern blot和序列分析结果表明, RA68在水稻基因组以单拷贝存在, 定位于第2号染色体. Northern杂交结果表明, RA68在幼芽和花中表达量较高, 在根和叶中不表达. 花和幼芽进行原位杂交分析结果表明, 在花中, RA68在花粉母细胞、二分体细胞、单核花粉粒以及大孢子囊中表达. 基于该基因的表达特性及其编码蛋白质的结构特征, 探讨了其在花发育中的可能功能.     

优系青蒿法呢基焦磷酸合酶基因的克隆和酶学分析

从青蒿(Artemisia annua L)高产株系025的cDNA文库中克隆到了一个编码青蒿法呢基焦磷酸合酶(AaFPS1)的cDNA(af1). 序列分析表明, 这一cDNA编码一个含343个氨基酸残基的蛋白质, 分子量为39 kD. 推导出的氨基酸序列与来自其他植物、哺乳动物及酵母的FPS相似, 也包含异戊烯基转移酶和聚异戊烯基合酶所共有的5个保守域. 此cDNA在大肠杆菌中的表达产物表现出明显的FPS酶学活性. 通过离子交换层析纯化后, 进一步测定了其酶学动力学. 上述结果将进一步推动青蒿素生物合成分子调控的研究.     

中国观音座莲植物的系统发育和起源时间: 来自叶绿体rbcL和trnL-F序列的证据

莲座蕨(Marattioid ferns)是一类公认的古老原始蕨类植物, 其化石记录可以追溯到中石炭世, 现存类群广布于世界热带及亚热带, 其中种类最丰富的类群——观音座莲科Angiopteridaceae主产亚洲. 关于观音座莲科的系统演化关系至今存在争议, 本研究基于叶绿体rbcL基因和trnL-F基因间隔区序列, 用MEGA2和MrBayes v3.0b4软件包分析了中国观音座莲科观音座莲属Angiopteris与原始观音座莲属Archangiopteris的系统演化关系; 基于系统发育树和化石记录资料, 进一步估算了观音座莲植物起源与多样性分化的时间. 结果显示, 观音座莲属和原始观音座莲属组成一个支持率很高的单系类群, 无论是rbcL序列, 还是trnL-F序列, 单独的序列分析均不能将观音座莲属和原始观音座莲属区分开, 从而证实观音座莲属和原始观音座莲属具有密切的亲缘关系; 而rbcL基因和trnL-F基因间隔区序列的联合分析提高了各个分支的支持率, 并且显示原始观音座莲属较早分化出来, 位于支系的基部, 从而不支持原始观音座莲属由观音座莲属演化而来的观点. 分歧时间的估计显示, 现存观音座莲属与原始观音座莲属发生多样性分化的时间仅约为26 Ma. 系统发育分析和分歧时间的估计结果表明, 现存的观音座莲属和原始观音座莲属植物的演化是以起源古老但多样性分化较晚为特征, 而非通常所认为的古老残遗类群.     

农杆菌介导法获得转pac1基因小麦并表现对大麦黄矮病毒的抗性

自裂殖酵母中克隆得到pac1基因, 与GenBank中相关的核苷酸序列有99.3%的相似性. 编码蛋白质序列分析表明, 其具有RNaseⅢ结构域和双链RNA结合结构域. 体外活性测定表明, 以pET-5a系统在大肠杆菌中表达的pac1产物能够降解dsRNA. 将pac1导入双元载体pBI121, 以培养7~10 d的小麦幼胚为受体材料, 利用农杆菌株LBA4404对小麦品种陇鉴127进行转化, 获得了41株G418抗性植株, 经点杂交(dot blot)、RT-PCR和nptⅡELISA检测证实, 其中25株整合有外源基因并能正常表达. 对这25株转基因小麦进行大麦黄矮病毒的抗性鉴定表明, 有12株表现低度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时发病且严重; 有12株表现中度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时局部有不严重症状; 有1株表现高度抗性, 两种情况下均无症状. 抗性实验结果表明了pac1介导的抗性具有剂量效应的特点.     

青藏高原三江源地区高寒草甸土反硝化细菌多样性的初步研究

应用PCR-RFLP和测序分析首次对青藏高原腹地三江源自然保护区高寒草甸土壤反硝化细菌基因(nirK和nosZ)的多样性和系统发育进行了探讨. 研究选用了4个海拔在4600 m以上的高寒草甸样地, 主成分分析表明样地间具有不同的理化性状. 经过PCR-RFLP分析, 在4个样品中分别获得253个nirK基因克隆和283个nosZ基因克隆, 其中nirK基因具有78个可操作分类单元(OTUs), nosZ基因具有120个OTUs. 环境因子分析表明, 海拔高度和土壤C/N比可能是影响土壤反硝化细菌的重要因素. 本研究还选取了36个nirK克隆和17个nosZ克隆进行部分基因测序分析, DNAMAN比较表明, nirK和nosZ基因序列间分别具有69%~98%和57%~97%的相似性. 在系统发育树中, 序列都可以分为4个不同的簇, 部分测定的基因序列与属于Proteobacteria的3个系统发育亚簇(α, β和γ)的已知反硝化细菌具有一定的亲缘关系, 另外一些序列与非培养细菌具有较近的亲缘关系.