CRISPR/Cas基因组编辑技术及其在农作物品种改良中的应用

CRISPR/Cas是存在于细菌及古细菌中成簇的、规律间隔的短回文重复序列及其核酸酶系统,是细菌和古细菌中破坏噬菌体与外源DNA的免疫防护机制.科学家将该免疫防护机制改造成了简便高效的基因组编辑工具,并在微生物、动物及植物的基因功能解析及改良方面取得了巨大的进展.本文先对基于CRISPR/Cas开发的植物基因组编辑工具,如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas介导的同源重组、胞嘧啶碱基编辑器、腺嘌呤碱基编辑器、双碱基编辑器和引导编辑器等进行介绍,接着详细阐述了在作物分子育种中越来越重要的DNA-free CRISPR/Cas植物基因组编辑技术,然后探讨了CRISPR/Cas基因组编辑技术在提高作物产量和品质、提高作物对生物及非生物逆境抗性、从头驯化及定向改良等方面的应用,分析了CRISPR/Cas植物基因组编辑技术的发展趋势、促进该技术应用的国家政策导向及社会环境,以便更好地促进CRISPR/Cas基因组编辑技术在农作物品种改良中的应用,助推我国种业振兴和藏粮于技战略的实现.     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在脑科学中的应用策略

基因编辑是对生物体基因组的目标基因进行精确切割、插入等操作.CRISPR/Cas9技术是基于向导RNA识别DNA靶序列,Cas9蛋白作为核酸酶切割DNA靶点来实现基因编辑.该技术自2012年报道以来已被不断改进,因具有普适、高效、简便等优点,迅速成为现阶段应用最广的基因编辑技术.在脑科学领域,CRISPR/Cas9技术不仅可应用于离体神经细胞,也可以在受精卵期、胚胎期或成年期应用;应用目的涉及脑基因与功能研究、基因敲除/敲入小鼠模型的构建、某些疾病的实验性治疗等.尤其是在一些遗传性疾病如视网膜色素变性、亨廷顿病的动物模型上,CRISPR/Cas9方法已经初步展示了令人鼓舞的治疗效果.未来,该技术将会在精确编辑效率与可控性方面有进一步提升,并可能在脑定向导入方法、脑神经环路解析等专业应用环节获得显著的发展.     

CRISPR/Cas介导的非转基因植物基因组编辑

CRISPR/Cas介导的基因编辑系统已成为生命科学研究领域不可或缺的工具,在植物基因组编辑方面也应用广泛.传统的CRISPR/Cas编辑系统仍依赖于外源DNA整合于宿主植物的基因组,属于传统转基因的范畴.由于公众对转基因作物安全性的担心,很多国家制定了针对转基因植物的严格监管政策,使相关产品的应用受到了极大的限制.如何在改造植物性状的同时,消除外源基因插入的影响是科学家们要解决的重要问题.近年来,利用CRISPR系统创制DNA-free的植物基因编辑产品的技术应运而生,得到了学术界的高度关注.利用该系统在引发目的基因突变的同时,没有外源DNA片段插入到植物基因组中,因此可有效减低监管风险,推动基因编辑作物的产业化应用推广.本文对目前基于CRISPR/Cas系统进行DNA-free的植物基因编辑的研究进展进行了总结归纳,包括DNA-free基因编辑技术的方法、在植物育种上的应用及前景展望等方面,同时分析了目前该技术所存在的问题并提出改进建议.本文将对这一领域的研究工作提供参考.     

多重靶向纳米递送系统为CRISPR/Cas9体内编辑提供输运工具

<正>CRISPR/Cas9系统是近年来发展起来的一组强大的基因编辑工具.CRISPR/Cas9系统可以对哺乳动物细胞进行基因编辑~([1]).CRISPR/Cas9由两部分构成,一部分是可以对DNA序列进行酶切的Cas9内切核酸酶,它可以引起靶标DNA的双链断裂;另一部分为引导RNA(guide RNA,gRNA),它可以特异性识别并结合DNA靶序列.在gRNA     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗β-地中海贫血的最新进展

地中海贫血是β-珠蛋白基因(HBB)点突变或缺失引起的单基因遗传病,患者产生溶血性贫血,其生存主要依赖于反复输血及去铁治疗,最终导致多器官受损、衰竭,给个人、家庭和国家带来严重的经济负担.随着基因编辑技术的蓬勃发展,可能治愈基因突变性疾病的基因治疗应运而生,其中CRISPR/Cas9基因编辑技术凭其靶向特异性、经济性等优势备受关注,并已广泛应用于分子生物学以及生命科学领域的研究.如今CRISPR/Cas9基因编辑技术修复人多能干细胞HBB基因、诱导胎儿血红蛋白(HbF)合成或抑制α-珠蛋白基因(HBA基因)表达是治愈β-地中海贫血的三大可行性策略,相关临床试验已相继开展.本文就CRISPR/Cas9系统的研究进展、作用机制以及在治疗β-地中海贫血的最新研究与应用进行综述,涉及细胞实验、动物模型、临床试验等内容,并介绍了CRISPR/Cas9系统衍生的新型基因编辑工具碱基编辑器在该领域的研究应用,为促进β-地中海贫血从基础研究转向临床治疗提供新的思路和方向.     

CRISPR-Cas9技术发展史:25年的科学历程

CRISPR-Cas是一种重要的原核生物获得性免疫系统。CRISPR序列可转录并加工为非编码RNA——cr RNA,而Cas利用其DNA核酸外切酶完成RNA介导的靶DNA剪切,从而抵御噬菌体和质粒等DNA的入侵。在这一系统基础上改进并发明目前生命科学领域广泛应用的CRISPR-Cas9基因编辑技术。通过对CRISPR序列发现、结构命名、功能预测、实验证实、机制研究和系统改进等的描述,以期能对CRISPR-Cas9技术的诞生过程有一个全面的了解。     

对话周琪:华盛顿共识

正基因编辑技术的飞速发展,特别是近年来CRISPR技术的广泛应用,使得人类拥有了前所未有的改变和修饰基因组的能力.CRISPR技术来源于细菌本身对抗噬菌体的"免疫系统".这项技术利用单链引导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白,可以在体内和体外简单、迅速、低成本实现基因编辑.2012年以来,CRISPR技术已经广泛地被全球应用于各个实验室,进行几     

基因编辑技术何去何从

正各种咨询机构、科技组织和资助机构都十分关注人类基因组编辑,医学及伦理学研究者黛布拉·马修斯(Debra J.H.Mathews)、罗宾·洛弗尔·巴杰(Robin Lovell-Badge)及同行们对此提出了一些需要重点考虑的问题。基因编辑工具CRISPR/Cas9的易用、准确和高效性使其在研究中得到广泛使用,而且在农业和涉及非生殖细胞(体细胞)的基因疗法中也有了初步的应用。CRISPR/Cas9及相关技术也可使用在某些     

基因编辑技术:一场正在进行的革命——伊曼纽尔·查朋特访谈录

<正>2012年,伊曼纽尔·查朋特(Emmanuelle Charpentier)在研究中与他人共同发现了CRISPRCas9系统:一个正在改变着基因组学、遗传学和基因工程领域的工具。CRISPR-Cas系统是由RNA和蛋白质构成,可以识别入侵病毒DNA并可将其分解(CRISPR表示成簇规则性排列的短回文间隔重复序列,用于描述基因的排列方式)。对于许多细菌和古细菌而言,该系统就相当于一个有效的免疫系统,可以广     

细菌转录翻译偶联机制研究

中心法则描述了遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的传递过程。转录过程是RNA聚合酶以DNA为模板合成信使RNA的过程,翻译过程是核糖体利用信使RNA合成蛋白质的过程。与真核生物不同,细菌和古菌没有细胞核膜的分隔,其转录过程和翻译过程在相同时间、相同位置上进行。其中,RNA聚合酶与核糖体相互协同,同步完成转录和翻译的现象被称为转录翻译偶联。转录翻译偶联是细菌和古菌的一种重要基因调控机制,能同时有效地调控转录过程和翻译过程,是细菌适应复杂环境的重要生物学基础。数十年来,大量的研究逐步揭示了细菌转录翻译偶联机制在细菌基因表达调控中的作用,一系列参与转录翻译偶联过程的调控因子也被鉴定发现。近期,基于不同偶联状态的转录翻译偶联复合体结构的突破性研究,首次系统地展示了在不同信使RNA间距下,转录翻译偶联过程的动态变化,为后续研究转录翻译偶联基因调控机制提供了理论基础。     

真核细胞基因中存在插入顺序

关于基因表达的知识,大部分来自对简单的原核细胞(如细菌)的研究。原核细胞中,基因的DNA首先转录为被叫作信使核糖核酸(mRNA)的相应的RNA分子,然后,mRNA又指导充当细菌细胞的酶或起结构成份作用的蛋白质的合成。真核细胞基因的表达则与细菌大不相同。例如,有些科学家发现,真核细胞的许多基因的某些核苷酸顺序,在相应的mRNA中不能找到,它们被称为插入或间隔顺序。     

人类线粒体DNA中碱基缺失/插入的真伪能否从世系的系统发育关系来推断?

从线粒体DNA世系的系统发育关系角度来说, 稀少的点突变在多个不同世系(或者说单倍型类群)中出现, 就很有可能是错误的. 这条对mtDNA序列中观察到的稀少的点突变进行检验的经验是否对序列中出现的碱基缺失/插入也适用, 目前未见报道. 本研究中统计了国内50个不同人群2352个个体mtDNA序列中出现的一些稀少的碱基插入/缺失事件. 结果显示, 除去单倍型类群特征性或相关性的碱基缺失/插入外, mtDNA序列中的碱基插入/缺失事件, 特别是发生的位置上含有该突变碱基(碱基对)重复的时候, 基本上不能通过世系系统发育关系来判别其准确性. 对于研究中偶尔观察到的个别稀少的碱基插入/缺失事件, 建议进行独立多次的序列测定予以核实.     

分子信标连接体系用于核酶切割产物的超灵敏检测

建立了一种新的核酶切割产物的超灵敏检测方法. 利用分子信标作为核酶切割产物的连接模板和检测分子, 在RNA/DNA核酸杂合体连接过程中, 核酶切割产物的信息被实时转换为荧光信号. 该方法实现了在不标记核酶或RNA底物的情况下, 高灵敏、高特异性地检测核酶切割产物, 检测下限可达 0.05 nmol/L. 为真实准确地反映核酶切割反应提供了一种简便快捷的非同位素分析方法, 也为核酶基因药物的快速筛选、核酶动力学、核酶在基因治疗中的深入研究提供了全新的思路和技术. 应用该方法对丙型肝炎病毒锤头核酶的切割产物进行了检测.     

植物DNA从头甲基化的机制

DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰,与基因的表达调控、转座子的沉默及异染色质的形成等紧密相关. DNA从头甲基化是指在新位点建立甲基化修饰的过程.植物中存在多个DNA从头甲基化通路,主要分为RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation, Rd DM)及CMTs(CHROMOMETHYLASEs)参与的从头甲基化.Rd DM通路在非编码RNA的介导下靶向建立甲基化修饰,可调控植物多类生长发育过程.伴随着研究的深入,多条非经典的Rd DM通路得以发现,这些通路在转座子的识别和沉默方面有着重要作用.此外,非模式植物中的研究还对CMT3参与从头甲基化的机理进行了探索.基于DNA从头甲基化机制,最近的研究开发了多种靶向DNA甲基化操控工具,这些工具将推进对DNA甲基化功能的认识,并有望进一步用于遗传操控进行作物改良.本文综述了植物DNA从头甲基化机制的最新研究进展,并针对该机制的应用进行了讨论.     

CRISPR专利环境的不确定性

<正>CRISPR-Cas9知识产权的专利战与这一技术本身一样,是一段颇具传奇色彩的微妙故事。2012年5月,加利福尼亚大学(UC)伯克利分校为生物化学家詹尼弗·杜德纳(Jennifer Doudna)和维也纳大学的埃马纽埃尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)开创性的细菌CRISPR-Cas9基因编辑系统申请了专利,他们在观察研究中发现,该系统可通过重新编程向导RNAs靶向到不同的DNA序列。之后,博德研究所(隶属于麻省     

脱氧核酶在生物检测及基因治疗中的研究进展

脱氧核酶(DNA zyme)是通过体外筛选技术获得的有酶活性的单链DNA分子.随着越来越多的脱氧核酶被筛选出来,科学家对其功能性质的研究也逐渐深入.其中,RNA切割作用作为脱氧核酶最重要的一种特性,是目前研究热点.而脱氧核酶发挥RNA切割作用需要辅因子(金属离子、中性分子、细菌等),因此,基于此特性,DNAzyme不仅被广泛用于金属离子和生物分子检测,而且被应用于特异性切割mRNA阻断蛋白的翻译,从而用于多类临床疾病的治疗.本文系统总结了DNAzyme在金属离子和生物分子检测以及在基因治疗方面的研究进展,并对其在动物体内对目标分子的高灵敏度、低浓度特异性检测及发挥切割活性进而达到疾病治疗做出了展望.     

反义RNA阻抑基因表达的精确模型——萤火虫荧光素酶基因-爪蟾卵母细胞系统

80年代建立的“反义基因操作技术”不仅打破了通过基因突变认识基因的局限,成为了解基因功能新的有效工具.而且,还拓宽了借助基因操作治疗疾病和改良植物品质的应用途径。虽然,至今仍未取得真核细胞能利用自身存在的反义RNA调节基因表达的证据,但是,人工构建的反义RNA或反义基因能有效地抑制细胞内源或外源基因的暂时性或稳定性表达已有越来越多的报道.只是对抑制机理,最适抑制条件等仍了解很少.本文报道含荧光素     

CRISPR-Cas9基因编辑技术在乙型肝炎病毒治疗中的应用

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)能引起患者慢性感染,增加肝硬化和肝癌的风险,是威胁全球健康的一个重要问题.核苷(酸)类似物(NUCs)和干扰素(IFN)是目前治疗HBV仅有的两类药物,然而这两类药物均无法清除稳定存在于细胞核中且能够作为模板产生子代病毒的闭合共价环状DNA (covalently closed circle DNA, cccDNA).此外, HBV耐药相关突变(RAM)和疫苗逃逸突变(VEM)降低了现有治疗和预防策略的成功率.因此,人们在努力开发直接靶向cccDNA,将之失活或清除以实现治愈慢性乙肝的治疗手段.特异性靶向HBV基因组保守区域的CRISPR-Cas9基因编辑系统,不仅能够有效抑制病毒复制,相比其他基因编辑工具,设计也更加简单灵活,成为了一个十分具有吸引力的治疗选择.本文将总结现有CRISPR-Cas9系统在抗乙型肝炎病毒中的研究,并探讨其可能面临的问题与潜在的解决方案.     

以EBV复制子载体为基础的新型重组AAV载体包装系统

重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是能建立稳定表达的转导型表达载体,可用作基因治疗的外源基因荷载工具.与逆转录病毒相比,它具有高安全性、无致病性和能感染有丝分裂后细胞等的特点.目前重组AAV的制备,需要两种不同的重组AAV质粒,一种是含位于AAV基因组两端的为病毒复制和包装所必需的反向末端重复(Inverted ter-minal repeats,ITR)和外源基因的重组表达质粒载体;另一种质粒作为助手质粒,克隆了除两端ITR外的AAV全基因组DNA,它反式提供AAV复制和包装所需的病毒蛋白,当这两种质粒共转染宿主细胞时,如存在辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)的感染,就能包装出含外源基因的重组AAV假病毒颗粒.     

太古代生命对环境温度的适应性进化

科学家通过对细菌和古菌以及早期地球环境的分析,推测地球上生命的共同祖先(LUCA)是在嗜热环境中形成并生存的,但早期生命的遗传物质是RNA,而RNA在高温环境下是不稳定的.法国里昂大学Manolo Gouy与合作者利用现代分子进化模型分析了核糖体RNA和蛋白序列,结果支持在生命树的进化历史上