一种基于定量驱动策略和18O标记方法的比较蛋白质组学分析平台

定量蛋白质组学技术是一种高通量的蛋白质分析技术, 有望大大推动生物学和医学研究的发展. 最近提出了一种基于定量驱动的定量蛋白质组学分析新策略, 它采用定量和定性分析分开的模式, 先通过液相色谱一级质谱(LC-MS)定量分析确定差异肽段, 然后针对这些差异肽段再做液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)定性分析, 最后通过定性和定量数据的匹配来获得差异蛋白结果. 这种策略被证明可以针对性地鉴定差异肽段, 增加差异蛋白的检测个数. 我们基于该策略和18O标记方法建立了一种新的定量蛋白质组学分析平台. 研究证明了该分析平台在定量蛋白质组学研究中的可行性. 本文还根据此研究在理论上提出了一种新的MS/MS分析的数据依赖模式, 即实时定量依赖的MS/MS离子选择模式.     

蛋白复合物与相互作用谱和表达谱的相关性分析

蛋白相互作用是指细胞内蛋白-蛋白间的物理相互作用, 通过酵母双杂交系统和基于质谱的蛋白吸附沉淀技术, 在酵母细胞中获得了大规模的蛋白相互作用数据. 收集了文献报道的共2617个酵母蛋白的11855条相互作用. 通过分析酵母细胞的大规模基因表达谱数据, 获得不同基因间表达的相关性. 蛋白复合物数据也可以获得, 并能转换成蛋白两两关系数据. 综合分析蛋白复合物、蛋白相互作用数据和基因表达数据可以发现三者之间的相关性. 结果显示, 有相互作用或表达谱相似的蛋白都比随机抽取的蛋白同属一蛋白复合物的几率高; 并且, 有相互作用且表达谱相似的蛋白同属一蛋白复合物的几率更高. 这一研究表明, 对现有的大规模蛋白复合物数据、蛋白相互作用数据和基因表达谱数据进行整合、分析, 可以揭示它们之间的关联性, 并且有助于获得这些数据蕴含的公共信息. 这种研究方法对于其他的大规模数据, 如蛋白组数据、表达谱数据、蛋白的细胞定位数据和表型数据的综合分析有很好的借鉴意义.     

电喷雾离子阱质谱法鉴定人肝癌细胞双向凝胶电泳胶内蛋白质

质谱法鉴定双向电泳胶内蛋白质是目前蛋白质组研究中最重要的分析方法．采用电喷雾离子阱质谱法对人肝癌细胞系ＢＥＬ－７４０４双向电泳后的胶内蛋白质进行分析鉴定．蛋白质经双向电泳分离,从凝胶上切割后,经过胰蛋白酶胶内酶解,通过液相色谱－电喷雾离子阱质谱分析肽谱和各肽段的氨基酸序外．根据肽谱和序列信息,经数据库检索,结合双向电泳分离获得的蛋白质分子量和等电点信息,对９种胶内蛋白质进行了鉴定．获得的氨基酸覆盖率为对２１％～７２．２％．其中两种蛋白质在ＳＷＩＳＳ－２ＤＰＡＧＥ的肝细胞蛋白质组数据库中尚未报道．在此基础上,进一步探讨了所鉴定的蛋白质与肝癌发生的关系．这一方法的应用,为与疾病相关的蛋白质组研究提供了有效和快速的分析鉴定方法．     

哺乳动物驱动蛋白的计算基因组学分析与鉴定

提供了一种新颖的、基于比较基因组学方法的全长驱动蛋白预测方法(full-length kinesin prediction program, FKPP), 用于哺乳动物中驱动蛋白质组的鉴定与研究. 之前的预测认为, 哺乳动物共含94个驱动蛋白, 而用FKPP从哺乳动物的基因组中总共鉴定出134个可能的驱动蛋白基因. 基于数据库中存在的片段序列, 用FKPP鉴定出25个可能的全长驱动蛋白. 此外, 用FKPP方法发现人的动点马达蛋白CENP-E应包含2701个氨基酸, 而不是当初根据克隆预测的2663个氨基酸. 通过对CENP-E的cDNA进行重测序, 并同时采用特异性识别FKPP预测的CENP-E多肽抗体予以实验评估, 结果表明, FKPP预测的CENP-E氨基酸序列是正确的. 为此, 本研究利用FKPP对哺乳动物的驱动蛋白进行了重新分类. 鉴于目前公共数据库含有较多非全长序列的蛋白片段, FKPP可提供一个具有显著效率且准确新颖的全长序列预测手段, 用于驱动蛋白以及其他蛋白家族的分子鉴定.     

C2H2锌指蛋白药物递送技术的研发与应用

锌指蛋白是真核生物中广泛存在的转录因子，在基因的表达调控中起着重要作用。近期研究发现，C₂H₂类型的锌指蛋白(通过两个半胱氨酸和两个组氨酸螯合锌离子)可通过巨胞饮进入哺乳动物细胞。进一步的研究发现C₂H₂锌指蛋白可介导多种模式蛋白质及药物蛋白质的高效细胞递送，其细胞穿透效率亦高于传统的细胞穿膜肽。文章介绍了锌指蛋白的基本生物学信息和其细胞穿透特性，并讨论C₂H₂ 锌指蛋白在大分子药物递送中的应用。     

费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)盐激蛋白质组学研究

用差异显示蛋白质组学方法, 对费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii) RT19在无盐以及盐激5和50 min条件下的蛋白质表达图谱进行研究. 结果表明, 在无盐时, 该菌株呈现的蛋白数目是481个. 随盐激时间的延长, 其蛋白质数目减少, 在盐激5和50 min时分别是465和424个蛋白质. RT19在盐激后, 有82个差异蛋白出现, 其中诱导表达的蛋白有26个, 阻抑表达的蛋白有23个, 表达量上调的蛋白有12个, 表达量下调的蛋白点21个. 而且不同的盐激时间还出现不同的差异蛋白, 说明其细胞内存在复杂的应答盐激的蛋白质网络调控. 应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)对26个盐激诱导蛋白进行检测, 将获得的肽质纹图谱经过数据库检索, 已初步确定21个诱导蛋白的功能, 其中包括与盐胁迫、γ-丁酰甜菜碱、脂多糖合成、代谢途径和信号传导等有关的酶.     

血海撒网捕捞诊断靶标技术取得进展

肝纤维化的非创伤性检测手段研究, 一直是临床应用研究的一大热点. 最近研究报道, 利用定量蛋白质组学手段, 发掘了一批肝纤维化分级相关的血浆蛋白候选标志物, 为推动临床上对肝脏纤维化非创伤性精确诊断提供了重要数据     

终端等重同位素标记串级质谱定量技术:高通量、高准确度的肿瘤标志物筛查新方法

癌症的攻克和预防需要更为灵敏和特异的早期诊断和术后控制标志物.基于生物质谱的定量蛋白质组学技术由于灵敏度高、分析速度快、通量高,在肿瘤标志物的筛查中得到了广泛的应用.终端等重同位素标记串级质谱定量方法,通过对肽段的N端和C端进行互补的同位素标记产生等重标记的肽段,在一级质谱中呈现相同的质荷比,而在串级质谱中产生碎片离子对用于蛋白质的定性和定量.该方法以其简单的操作、高准确度和高通量的优势为生物标志物的发现提供了多种新的思路,为肿瘤标志物筛查提供新的手段.本文综述了终端等重同位素标记串级质谱定量方法的最新发展及其在生物标志物研究中的应用.     

人体内有多少种蛋白质

2005年Science提出了"人体内有多少个蛋白质?"这一科学问题.随着人类基因组计划的不断完善,以及"后基因组时代"在蛋白质组学方面研究的不断深入,科学家们都尝试来回答这一有趣的问题.经典分子生物学认为,一个基因只能表达一种蛋白,人类基因组含有约24000个基因,但蛋白质种类有50000多种甚至更多,显然可能有些基因可以表达的蛋白至少超过两种以上,才能够使机体复杂的功能需求得以满足.至今为止,科学家们对人体内蛋白质具体数量还没有达成共识.本文结合真核模式生物的进化、基因编码、蛋白质修饰以及当前蛋白质组学技术发展,综合分析人体内可能存在多少种蛋白质,希望能够为回答这一科学问题提供一定的帮助.     

稻瘟病菌坏死和乙烯诱导肽1样蛋白的原核表达、纯化与活性分析

坏死和乙烯诱导肽1(necrosis and ethylene-inducing peptide 1, Nep1)样蛋白(Nep1-like proteins, NLPs)是一类广泛存在于细菌、真菌及卵菌中的分泌型蛋白.本研究通过生物信息学分析了稻瘟病菌中的4个坏死和乙烯诱导肽1样蛋白的家族基因成员的相关信息,克隆了它们的编码区序列,分别将它们构建到了pGEX-6P-1载体中.通过优化诱导条件对它们进行了原核表达、纯化,获得了相应的可溶性目的蛋白,进一步将纯化的目的蛋白注射到烟草叶片中,发现N端融合GST标签的MoNLP1、MoNLP4蛋白仍具有生物学活性,可以明显诱发烟草叶片组织产生细胞坏死.该研究为进一步深入研究该基因家族在稻瘟病菌中的功能与作用以及开发更多潜在的植物蛋白激发子奠定基础.     

新型HLA-A2限制的B, C型HBV特异性CTL表位的筛选及鉴定

乙型肝炎病毒(HBV)特异性CD8+ T细胞(CTL)介导的细胞免疫应答在控制HBV感染和病毒清除中至关重要, 已鉴定的T细胞表位绝大多数都来自A, D基因型的乙肝病毒, 而在我国流行的B, C型病毒表位研究较少. 本研究合成重叠九肽肽库, 通过细胞结合试验和体外重折叠实验系统筛选和鉴定B型和C型HBV核心蛋白表位, 发现一个在60位氨基酸由L变异成V(L60V)而产生的新表位HBcAg60-68. 表位肽能在HLA-A2/K^b转基因小鼠体内激发特异性CTL细胞免疫反应. 检测HLA-A2阳性乙肝患者表位特异性CTL证明该九肽序列为体内自然加工的表位, 这为研究HBV感染中特异性CTL免疫应答提供新的依据.     

植物环蛋白的薄层层析显色反应

用碘、碘化铋钾、茚三酮和考马斯亮蓝G-250四种显色剂对包括植物环蛋白在内的3种寡肽以及氨基酸和蛋白质在薄层层析板上进行了5组显色反应研究. 结果表明, 可以综合考马斯亮蓝G-250和水解前后对茚三酮的显色来识别环蛋白. 应用该显色方法开展了三色堇、紫花地丁、如意草、木鳖子和苦瓜等5种植物的环蛋白的检测和纯化工作, 均检测出环蛋白, 并分离获得十多个环蛋白, 鉴定了其中的3个, 为已知环蛋白cycloviolacin O2, kalata B1和vary peptide A.     

结缔组织生长因子诱导肾成纤维细胞转为成肌纤维细胞

结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF)是介导转化生长因子（TGF-β）促纤维化效应的蛋白，但它能否诱导肾脏慢性纤维化中的关键细胞，即间质成纤维细胞转化为成肌纤维细胞（myofibroblast0，目前尚无报道。实验应用体外基因转染技术建立稳定表达CTGF蛋白的肾间民纤维细胞系，并观察在不同培养条件下成肌纤维细胞数量及其产生的生物学效应。结果发现细胞表达出的CTGF蛋白能直接诱导成纤维细胞转化为成肌纤维细胞，并增加细胞外基质胶原ⅢmRNA水平，提示CTGF可作为肾纤维化防治中的新靶位蛋白，为临床延缓肾脏疾病慢性进展提供新思路。     

兔出血症病毒衣壳蛋白与次级结构蛋白的相互作用

用真核细胞双杂交系统、免疫共聚焦技术和免疫共沉淀等方法,对兔出血症病毒(RHDV)的衣壳蛋白(VP60)和次级结构蛋白(VP10)在细胞内、外的相互作用进行了分析和鉴定.结果显示,RHDVVP60与VP10两种蛋白之间存在较强的相互作用,将VP60截为两大段后,其间的相互作用明显减弱,提示二者之间的相互作用依赖于衣壳蛋白结构的完整性.本研究将为进一步研究RHDV病毒颗粒的装配机制等提供有益线索.     

两亲性的蝎毒毒素扰动脂双层促进脱血红素细胞色素c跨膜运送

细胞质中合成的线粒体蛋白质大部分在N-端有一段导肽,导肽的两亲性对引导该蛋白质进入线粒体是很重要的。导肽的作用可能是对膜脂进行扰动以便使牵引的蛋白质通过脂双层。细胞色素c的前体——脱血红素细胞色素c(Apocytochrome c简称apocy.c)是在细胞质中合成的,它本身没有导肽,但它能自发地插入或通过人工膜,不同来源的apocyt.c可能由于N-端序列形成的二级结构的两亲性的差异导致其转运能力不同。     

CD2胞内区结合蛋白的分子克隆与鉴定

为了探讨ＣＤ２分子的信号传递功能,以编码ＣＤ２胞内区（Ｔｈ４２１１－Ｇｌｎ３３６）肽段的ｃＤＮＡ为“钓饵”,采用酵母双杂交系统从激活的人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白ｃＤＮＡ序列,并采用免疫共沉淀法鉴定该蛋白在体内ＣＤ２胞内区结合的特异性,克隆并鉴定了一个与ＣＤ２胞内区特异性结合的胸内蛋白分子与ｖ－ｆｏｓ转化效应蛋白（Ｆｔｅ－ｌ）同源,Ｆｔｅ－１参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体     

蛋白质二硫键异构酶的二硫键不是其活力所必需

蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase,PDI,EC 5.3.4.1)催化蛋白质分子中疏基与二硫键的交换反应,并被普遍认为催化细胞内蛋白质生物合成过程中天然二硫键的形成.虽然根据PDI的cDNA序列所推断的氨基酸序列中,每个亚基只含6个Cys残基,完全还原的PDI在不同的实验室所测得的疏基数目却都为7,Carmichael等报道,不经还原剂还原的PDI含有三个自由疏基和两对二硫键,但Gilbert等报道PDI含有三对二硫键.PDI亚基中含有两段高度重复序列1—100和350-450,这两段序列和大肠杆菌的硫氧还蛋     

一种新的微管相关蛋白JWA对细胞内氨基酸平衡有重要调节作用

探讨了JWA蛋白在细胞内的确切定位、与微管蛋白的相互关系及对细胞内氨基酸平衡的调节作用. 应用4~37℃(微管解聚-聚合)交替作用法提取纯化大鼠脑组织中微管及其相关蛋白; 用免疫共沉淀法研究JWA蛋白与微管蛋白的相互作用; 应用基因转染和免疫荧光等实验方法研究低温(4℃)、秋水仙素(1 × 10^-5, 5 × 10^-5 mol/L)等处理的HBE细胞/ NIH3T3细胞中JWA和微管的动态变化及相互关系. 应用反义寡核苷酸技术结合氨基酸分析技术探讨JWA蛋白对PC12细胞内氨基酸平衡的调节作用. 结果表明, JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白, 与微管蛋白分布基本平行, 在绝大多数情况下伴随微管动力学改变(聚合或解聚)而同步发生变化, 并且可能参与了细胞有丝分裂的过程. JWA蛋白是细胞内氨基酸总量的一种重要负性调节蛋白, 并选择性地调节细胞内谷氨酸和牛磺酸含量.     

蛋白激酶TTK与CENP-E相互作用并共定位于人细胞的动粒

纺锤体检验点（spindle checkpoint)是一个重要的细胞分裂化调节通路，监督染色体正确分离和传代，其信号传导主要通过两个蛋白激酶Mps1和Bub1/BubR1来调控，近期的研究发现动粒马达蛋白CENP-E与BubR1相互作用并参与纺锤体调控点的作用，为阐明纺锤体检验点分子调控机理，利用动粒蛋白质组学技术剖析人细胞动粒的蛋白质组成时发现了TTK蛋白-人细胞Mps1。揭示了TTK蛋白激酶定位于动粒，并与CENP-E相互作用，可能参与监控人细胞分裂过程中的染色体分离。     

水疱性口炎病毒L蛋白N端存在新的定位信号

水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV) L蛋白是该病毒复制酶的主要成分, 分子量约为241 kD. 通过构建L蛋白缺失突变体与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的方式, 将融合蛋白置于T7启动子或CMV启动子下游, 在多种动物细胞中瞬时表达了重组的融合蛋白. 荧光显微镜观察结果显示, 仅保留N端96个氨基酸残基或缺失N端120个以上残基时, 融合蛋白均匀分布于整个细胞质中, 而含有N端120个以上残基时, 融合蛋白呈点状或局部分布于核周围部位. 截取L蛋白96～120氨基酸片段, 连接到GFP蛋白氨基端, 同样融合蛋白亦特异性地分布到核周围局部区域. 进一步研究含定位信号的25个残基片段发现, 仅13个残基的肽段QGYSFLHEVDKEA(108 ~ 120)就具有定位功能, 缺失D或V均导致定位信号完全丧失. 含有这13个残基的GFP融合蛋白, 在多种细胞和不同表达模式下均显示了同样的分布规律, 表明L蛋白N端这种定位信号具有独立的定位功能, 并且在不同细胞中是保守的.