C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

利用人工控制细胞死亡策略培育抗稻瘟病水稻

利用细菌编码RNase的barnase 基因及其特异抑制剂编码基因barstar构成的双元组分系统, 把本实验室构建的具有稻瘟菌(Magnaporthe grisea)诱导活性的嵌合启动子与barnase基因融合, 再与由CaMV 35S启动子驱动的barstar的构件融合, 构建植物表达载体pWBNBS和pPBNBS, 转化水稻, 并对转基因水稻进行了抗稻瘟病和白叶枯病的检测. 结果表明, 接种稻瘟菌后, 转基因水稻植株中barnase基因受诱导表达; 在稻瘟菌侵染诱导下, barnase的表达超过barstar的抑制, 导致转基因水稻叶片出现类似过敏感应, 表现出对稻瘟病的抗性; 转基因水稻对白叶枯病表现出一定的抗性. 这些结果说明, 通过该双元组分系统策略获得的转基因水稻具有明显的抗致病性真菌和一定程度的抗细菌危害的较广谱抗性.     

根特异性表达顺式激活序列在转基因烟草中的功能分析

高等植物基因在各组织中的特异性表达需通过组织特异性启动子的调控。根是植物体的重要器官，其特异性基因的表达和调控对研究植物的生长和发育具有重要意义。通过对烟草根特异性表达基因TobRB7启动子的分析，成功分离了包含顺式激活序列 的不同长度的片段RSF1和RSF2。将RSF1和RSF2以不同方向与含有GUS编码基因的表达型载体进行重组后，以农杆菌介导转化烟草获得相应 的转基因植株。在对转基因烟草的GUS表达特性进行组织化学鉴定和荧光定量分析后发现，TobRB7启动子具有双向启动子功能，并均表现出根组织特异性。结果表明，在－823至＋70bp区域存在正反不同方向的根组织特异性调控元件，该启动子片段在反向插入和较短区域内有较强的根组织特异性表达调控功能。     

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中, 根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子. 结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化. 水稻是重要的粮食作物, 能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素. 将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因b-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2BP-GUS, 以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记. 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统, 获得了携带嵌合基因Gmenod2BP-GUS的水稻再生植株. 以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针, 检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2BP-GUS的表达. 结果表明, 转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导, 仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达, 并且受到氮源的调控. 推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.     

一个具有棉花纤维细胞特异性的启动子SCFP

为了获得棉花纤维特异启动子, 克隆了棉花纤维细胞中表达基因GhSCFP的5′端上游序列, 将其分别与GUS和GFP报告基因融合. 在转基因烟草中, 仅在种皮的最外层细胞中检测到GUS和GFP活性; 在转基因陆地棉中, 根、叶片、幼茎、花冠、花药和柱头中均未观察到GUS信号, 而在开花当天胚珠表面突起的纤维细胞中有明显的GUS活性, 直到开花后36 d, 纤维上仍可观察到GUS信号. 本研究结果显示, SCFP启动子具有明显的棉花纤维表达特异性和植物种皮特异性, 而且表达强度高. 该启动子在棉花纤维发育相关基因的功能研究和棉花基因工程改良中将有重要的应用价值.     

苜蓿根瘤菌四碳二羧酸运输系统(Dct)的诱导表达与氧浓度相关

研究了苜蓿根瘤菌Dct系统在大肠杆菌内受琥珀酸诱导表达与环境中氧浓度的关系. 将携带Dct系统的大肠杆菌DH5a菌株培养于含0.6%琼脂的M63限制培养基的试管内, 发现报告基因受琥珀酸诱导表达产生的蓝色条带出现在琼脂表面以下某一深度, 而不在琼脂表面, 表明Dct系统的表达在某个特定的氧浓度下有最大值. 随后将该菌株转入一系列不同氧浓度的密闭瓶内测定其受琥珀酸诱导表达的b-半乳糖苷酶活性, 结果表明当氧浓度为2%时, Dct系统的活性较氧浓度为21%的大气中的活性高出约1倍, 由此推测Dct系统不仅能感受四碳二羧酸的信号, 同时还具有感受氧浓度的新的功能.     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离及其启动子功能分析

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501氧胁迫下基因表达谱研究

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501分离自我国南方水稻田, 在低铵和微好氧条件下能紧密结合在水稻根表, 并侵入根内生长和固氮. 为探讨氧对A1501基因组表达的影响, 利用全基因组芯片技术, 研究不同氧浓度(0.5%, 21%)下A1501基因组表达谱, 结果表明: (ⅰ) 67个基因在高氧浓度下表达上调2倍以上, 其中17个基因的功能未知; (ⅱ) 68个基因在高氧条件下表达, 其中约50%的基因参与固氮或反硝化. 实时定量RT-PCR验证结果表明, 4个编码氧化还原酶的基因和7个编码胞外夹膜多糖和抗原寡糖合成的基因在高氧下表达上调, 其中sodC在高氧下表达上调2.7倍、编码黄素单胺氧化酶相关蛋白的基因PST1610表达上调2.2倍、编码α-酮戊二酸-铁氧化酶族氧化还原酶的基因PST3584表达上调3.2倍、编码NAD依赖型氧化还原酶的基因PST2179表达上调2.9倍. 这些基因及其表达产物可能在A1501氧保护机制中发挥作用.     

通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻

δ-OAT基因编码的鸟氨酸-δ-氨基转移酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径中的关键酶.采用基因枪法将拟南芥δ-OAT基因导入粳稻品种中作321,通过PCR及分子杂交分析确定目的基因已插入水稻染色体中并得到超量表达.抗盐抗旱检测结果表明,水稻在受到渗透胁迫时会大量积累脯氨酸,各种条件下转基因水稻积累的脯氨酸是对照的5～15倍;同等胁迫条件下转基因株系相对生长更快,苗与根的生物学产量都要高于对照,最后种子产量也显著高于对照,如在0.1 mol/LNaCl胁迫下转基因株系相对产量提高了16%～41%,说明δ-OAT基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要作用,通过转化δ-OAT基因可以获得抗盐抗旱的基因工程水稻.     

环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)参与人hsp90β基因的热诱导表达

为研究cAMP应答元件（CRE）在人热休克蛋白hsp90β基因表达中的作用，构建了数个受hsp90β基因不同长度调控片段介导的氯毒素乙酰基转移酶（CAT）报告基因质粒。分别转染Jurkat细胞并检测42℃1h热诱导前后CAT活性。结果发现删除hsp90β基因上游含CRE片段（－173／－91bp)后，CAT的热诱导表达活性降低了67％。电泳迁移率变更分析（EMSA）显示热休克后Jurkat细胞的核抽提物中磷酸化的CREB与该片段呈特异性结合。Western印迹实验及PKA活性检测发现CREB的磷酸化程度及PKA活性均随热诱导时间的延长而增加。以上结果表明：磷酸化的CREB通过与hsp90β基因上游的CRE结合参与该基因的热诱导表达，并可能与PKA传导途径有关。     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

低频、低压交变电场高效诱导基因转移

电场诱导基因转移以操作简单、转化率高、无细胞种属限制等优点被广泛应用到微生物、植物及动物细胞的基因转移中,其基本原理是:利用高压电脉冲造成膜的瞬间击穿,在膜上形成数纳米的孔洞,外源基因得以扩散进入胞内,从而实现外源基因的跨膜转移。这种穿孔在一定条件下是可逆的,但往往会造成50％左右的细胞的死亡。1990,Tsong首次报道了利用低频、低压交变电场将外源质粒DNA高效导入E. coli中,并发现交变电场作用后,且coli细胞100％存活,此后这方面的报道较少,更没有用到高等哺乳动物细胞的基因转移中。我们对真核细胞衣藻和Hela细胞分别以带有报告基因GUS的质粒pBI121、带有报告基因β-Galatosidase的质粒pSV-β-Gal作为模式外源基因进行了交变电场诱导基因转移的研究,结果分别得到了GUS基因、β-Gal基因的高效表达。     

转PEPC基因水稻的光合CO2同化和叶绿素荧光特性

以转PEPC，PPDK，NADP－ME，PEPC＋PPDK基因水稻及原种为材料，比较C4途径有关光合酶活性、叶绿素荧光参数、CO2交换等生理指标，重点研究了转PEPC基因水稻的生理特性，结果如下：（1）转PEPC基因水稻PEPC活性比原种高20倍，光饱和光合速率比原种高55％，羧化效率提高50％，CO2补偿点降低27％；（2）在高光强（3h）或光氧化剂甲基紫精（MV）处理后，与原种相比，转PEPC基因水稻的PSⅡ光化学效率（Fv/Fm)、光化学猝灭（qp)下降较少，证明其耐光抑制和耐光氧化能力增强；（3）在高光强条件下，转PEPC基因水稻中RuBPCase活性变化不明显，但碳酸酐酶（CA）诱导活性增加1．8倍。这些结果为揭示高光合效率机理和高光合效率育种提供了有益的启示。     

一个水稻铁转运基因(OsFRDL1)参与缺氧诱导根系铁膜形成的调节过程

根表铁膜是水稻重要的养分库和抵抗环境胁迫的天然屏障.然而根表铁膜形成的分子机制并不清楚.本文以日本晴野生型对照及Osfrdl1突变体为材料,研究了OsFRDL1基因在水稻根表铁膜形成中的作用.结果发现,低磷(0.02 mmol L-1)是水稻根表铁膜形成的重要条件.当处理溶液pH为5.0~6.0,FeSO4浓度为30~50μmol L-1时,根表铁膜含量最大.与通气处理相比,缺氧处理降低水稻根表铁膜含量;且缺氧处理时,Osfrdl1突变体根表铁膜含量低于野生型.实时定量PCR结果表明,缺氧处理显著增加OsFRDL1基因在根系表达,且根系基部的表达强度高于根尖.OsFRDL1::GUS染色结果表明,OsFRDL1::GUS报告基因主要在根系表皮细胞和维管束细胞表达;缺氧处理增加了报告基因在上述位置的表达.缺氧处理时,野生型比Osfrdl突变体根系具有较高的过氧化物酶活性.上述结果表明,缺氧处理诱导OsFRDL1基因的高量表达,使野生型与突变体相比,过氧化物酶活性维持较高的水平,从而使其铁膜生成量高于突变体.     

表达雪花莲凝集素(GNA)的转基因水稻纯系抗褐飞虱

利用基因枪法将含有潮霉素抗性基因pht,gusA报告基因和雪花莲外源凝集素基因gna的2个质粒（pWRG1515和pRSSGNA1)共转化粳稻品种鄂宜105号和鄂晚5号种子胚诱导的愈伤组织。从轰击的329块愈伤中共再生出61株独立转基因植株。PCR／Southern blot分析显示，79％的转基因植株含有所有3个外源基因。Western blot分析发现，48株含gna基因的转基因植株中有36株（75％）在不同水平上表达了GNA，GNA最高表达量占总可溶性蛋白的0．5％，遗传分析证实外源基因在转基因后代植株中大多以孟德尔方式遗传。从其R1代为3：1孟德尔分离方式遗传的后代R2代植株中，鉴定出含有并表达所有3个外源基因的5个独立转基因植株纯系。褐飞虱生物鉴定和喂养试验表明，转基因纯系对褐飞虱具有显著的抑制作用，具体表现为降低褐飞虱存活率和繁殖力、延缓褐飞虱发育进度及减少褐飞虱进食量，即表达GNA的转基因水稻纯系对褐飞虱具有抗性作用。     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

转PEPC基因水稻的光合CO_2同化和叶绿素荧光特性

以转PEPC, PPDK, NADP-ME, PEPC + PPDK酶基因水稻及原种为材料, 比较C4途径有关光合酶活性、叶绿素荧光参数、CO2交换等生理指标, 重点研究了转PEPC基因水稻的生理特性, 结果如下: (1) 转PEPC基因水稻PEPC活性比原种高20倍; 光饱和光合速率比原种高55%, 羧化效率提高50%, CO2补偿点降低27%. (2) 在高光强(3 h)或光氧化剂甲基紫精(MV)处理后, 与原种相比, 转PEPC基因水稻的PSⅡ光化学效率(Fv/Fm), 光化学猝灭(qP)下降较少, 证明其耐光抑制和耐光氧化能力增强. (3) 在高光强条件下, 转PEPC基因水稻中RuBPCase活性变化不明显, 但碳酸酐酶(CA)诱导活性增加1.8倍. 这些结果为揭示高光合效率机理和高光合效率育种提供了有益的启示.     

利用土壤农杆菌将天花粉蛋白基因转入水稻植株并检测抗稻瘟病活性

通过土壤农杆菌方法将天花粉蛋白基因转化到水稻中, 获得了具有单拷贝外源基因插入和表达的水稻再生植株. 抗稻瘟病(Pyricularia oryzae)检测发现, 接病菌后1个月内转天花粉蛋白基因植株在发病时间、发病植株数、发病叶片、发病后的植株生长状况等各项指标上与对照的转GUS基因植株比较均有较大差异. 在去除高湿度的发病环境后, 转天花粉蛋白基因植株的生长情况也明显优于对照植株. 表明转基因水稻对稻瘟病侵害至少有明显的延迟发病抗性. 天花粉蛋白基因在水稻中的表达未发现对宿主植物生长有明显影响.     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

胡萝卜lea基因cDNA片段的克隆及其表达特性分析

在ＭＳ培养基中加入高浓度的蔗糖，可使胡萝卜体细胞胚的发育静止于子叶胚阶段，而当蔗糖浓度恢复到正常水平时，静止的体细胞胚便转入胚后发育。采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，从调控状态的胡萝卜体细胞胚中获得ｌｅａ基因Ｄｃ３家族一个新成员的ｃＤＮＡ片段。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明，该基因在调控状态的胡萝卜体细胞胚中具有强表达活性；在解调控１２ｈ的胡萝卜体细胞胚中，表达活性明显降低；解调控２４ｈ之后，其表达活性则基