水稻条纹叶枯病毒分子生物学的研究——外壳蛋白分子量、氨基酸组成和N末端

水稻条纹叶枯病是水稻的主要病害之一,其病原为水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus,RSV)。RSV通过灰稻虱(Laodephax striatellus)等三种介体传毒,能侵染水稻、小麦、玉米等37种禾本科植物,引起严重减产。Koganezawa首次报道了RSV具有分枝线状结构,Toriyama提出RSV是三组分病毒,含有一种分子量为32000的外壳蛋白(CP)及4种单链RNA,最近他又在RSV颗粒中发现了相应的4种双链RNA。在我国水稻条纹叶枯病亦广     

大麦黄矮病毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜体内传毒相关蛋白的确定

应用双向电泳和病毒覆盖测定技术, 从大麦黄矮病毒麦二叉蚜和麦长管蚜株系(GAV)的传毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜的蛋白质提取物中检测到一种分子量为50 kD的蛋白(P50), 它与提纯的病毒有高的亲和反应. 对麦二叉蚜体内的P50进行了电泳分离并制备了家兔抗血清, 两种麦蚜饲食该蛋白的抗血清后, 传毒效率分别由对照的72.55%和73.44%下降为8.57%和28.56%, 表明该蛋白是参与病毒与介体麦蚜相互识别的传毒相关蛋白. 采用电子显微镜免疫胶体金对50 kD传毒相关蛋白进行麦蚜体内定位, 发现其存在于麦二叉蚜的头部唾液腺组织中, 揭示出麦蚜唾液附腺组织上的膜蛋白与病毒的相互识别是麦蚜能够传播大麦黄矮病毒的根本原因.     

小麦丛矮病毒的寄主植物

应用电子显微镜及免疫血清法,分别鉴定小麦丛矮病毒(WRSV)寄主植物。在大田采集自然发病并显出症状的有关病株作检测。还检测了在温室内用带毒灰飞虱接种引起发病并表现典型病状的一些病株。     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

乙烯信号转导途径在褐飞虱诱导的水稻挥发物释放中的作用

以水稻褐飞虱Nilaparvata lugens及其卵期寄生蜂稻虱缨小蜂Anagrus nilaparvatae为研究对象, 通过分析褐飞虱为害后水稻乙烯释放量的变化以及乙烯、水稻挥发物和对寄生蜂引诱作用三者间的关系, 研究了乙烯信号转导途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物释放中的作用. 结果表明, 在受褐飞虱为害后2~24 h, 受害稻株释放的乙烯浓度一直显著地高于未处理稻株; 利用乙烯利在酸性水溶液中释放的乙烯处理水稻后, 水稻能释放与褐飞虱为害株相类似的挥发物组成相, 并且两者表现出对寄生蜂相同的引诱活性; 在褐飞虱为害之前利用乙烯受体的抑制剂1-甲基环丙稀处理水稻, 可明显抑制褐飞虱诱导的大部分水稻挥发物组分, 并且对稻虱缨小蜂的引诱作用也受到抑制. 上述结果表明, 乙烯信号转导途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物释放中是必需的.     

与烟草曲叶病毒伴随的新型DNA分子鉴定

根据已报道的两种粉虱传双生病毒DNAβ分子的保守序列设计引物，利用PCR技术从烟草曲叶病毒Y5和Y8分离物扩增到一类环状DNAβ分子，其全长分别为1333和1338nt，序列分析表明，Y5DNAβ可能编码8个可读框（ORFs），病毒链和互补链各含有4个ORFs；Y8DNAβ可编码7个ORFs，病毒链含有4个ORFs，互补链含有3个ORFs，除茎环结构TAATATTAC外，DNAβ与烟草曲叶病毒Y5和Y8基因组DNA－A序列几乎无同源性，Y5和Y8的DNAβ全长核苷酸序列同源性较高，为85％，而与已报道的胜红蓟黄脉病毒（AYVV）DNAβ及棉花曲叶病毒（CLCuV）的两个DNAβ的同源性为51％－65％，免疫捕获PCR及粉虱传毒实验表明，DNAβ分子包裹在双生病毒粒子中，并伴随病毒由烟粉虱传播。     

表达雪花莲凝集素(GNA)的转基因水稻纯系抗褐飞虱

利用基因枪法将含有潮霉素抗性基因pht,gusA报告基因和雪花莲外源凝集素基因gna的2个质粒（pWRG1515和pRSSGNA1)共转化粳稻品种鄂宜105号和鄂晚5号种子胚诱导的愈伤组织。从轰击的329块愈伤中共再生出61株独立转基因植株。PCR／Southern blot分析显示，79％的转基因植株含有所有3个外源基因。Western blot分析发现，48株含gna基因的转基因植株中有36株（75％）在不同水平上表达了GNA，GNA最高表达量占总可溶性蛋白的0．5％，遗传分析证实外源基因在转基因后代植株中大多以孟德尔方式遗传。从其R1代为3：1孟德尔分离方式遗传的后代R2代植株中，鉴定出含有并表达所有3个外源基因的5个独立转基因植株纯系。褐飞虱生物鉴定和喂养试验表明，转基因纯系对褐飞虱具有显著的抑制作用，具体表现为降低褐飞虱存活率和繁殖力、延缓褐飞虱发育进度及减少褐飞虱进食量，即表达GNA的转基因水稻纯系对褐飞虱具有抗性作用。     

烟草曲叶双生病毒分子进化的初步研究

烟草曲叶病是烟草的主要病害之一,流行于热带和亚热带地区,其病原是烟草曲叶双生病毒(Tobacco leaf curl virus,TbLCV).TbLCV由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播,能侵染属于茄科(Solanaceae)和番木瓜科(Caricaceae)的许多植物.在我国蔡健和等曾报道TbLCV的寄主范围、传毒媒介和与非洲木薯花叶双生病毒的血清学关系.本文首次报道TbLCV外壳蛋白基因的核苷酸序列,在外壳蛋白氨基酸水平上比较与其它双生病毒的分子进化关系,为进一步研究其分子生物学特性奠定了基础.     

一种新型的非病毒DNA传递载体:多聚赖氨酸-硅纳米颗粒

DNA传递是基因表达与功能研究及其医学应用的重要技术。安全高效的DNA传递一直是人们梦寐以求的目标，伴随纳米生物技术发展而产生的纳米DNA传递载体为此带来了新的希望。通过OP－10／环己烷／氨水微乳液体系合成了不同粒径的硅纳米颗粒，并利用正交分析阐明了该体系中各组分对硅纳米颗粒粒径及其分布的影响；成功地在小粒径（约20nm）硅纳米颗粒表面修饰上多聚赖氨酸，研制出复合纳米材料－多聚赖氨酸－硅纳米颗粒。DNA结合分析及DNaseI消化实验发现，多聚赖氨 酸－硅纳米颗粒能有效结合和保护DNA。细胞转染实验发现，它能高效传递DNA进入HNE1细胞，并产生高水平的绿色荧光蛋白表达。这些结果表明多聚赖氨酸－硅纳米颗粒是一种．新型的非病毒纳米DNA传递载体，并将可能在基因表达与功能研究及基因治疗等领域发挥重要作用。     

利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的三维结构

利用低温电镜订和像重构方法测定了兔出血症病毒的三维结构，分辨率达到3．2nm，兔出血症病毒的三维结构显示了杯状病毒的典型特征。位于二十面体二次轴和局域二次轴位置的90个弧状突起以及位于五和三次轴位置的32个杯状凹陷排布在T＝3的二十面体衣壳上。因而从结构上表明中国株兔出血症病毒属于杯状病毒科，A，B壳粒之间相互连接，并且杯状凹陷底部未见隆起。兔出血症病毒衣壳壳层区由连续蛋白密度构成，未发现病毒RNA通道存在。从低温电镜像及三维密度图中可以分辨含基因组和含亚基因组两种病毒颗粒的存在。这两种病毒颗粒衣壳结构类似。     

我国北方稻区稻飞虱的成灾机制：一个假说

北方稻区地处稻飞虱北迁的波及区，稻虱问题一直被人们所忽视，致使灾变突发时猝不及防，１９９１年冀东飞虱大暴发便是最惨痛的教训。稻飞虱的飞行能力不超过３０小时，且迁飞方式为直达型，而迁出区与迁入区相隔１０００－１６００ｋｍ以上，南北稻区的发生程度也无直接的因果关系，是什么因素使得大发生虫源在不超过３０小时的一次连续飞行中到达了千余公里之外的北方稻区？本文通过对大量文献资料的综合分析，从飞虱的飞行特性和北迁运载气流入手，以东亚大气低层环流为背景审视飞虱在有限时间内远近北方致灾的成因机制，提出了以北上低空急流的时空变化与南方大发生虫源迁出期（区）相吻合、其前沿所至与北方迁入区相一致作为北方稻虱成灾的启动因子的假说，并提出了验证该假说的研究方法和技术路线，为揭示北方稻虱成灾的奥秘，完善灾变监测技术和预警系统奠定了基础。     

虫害诱导的水稻挥发物对褐飞虱寄主选择行为的影响

用固相微萃取（SPME）、Tenax-TA吸附剂法结合气相色谱（GC）以及气相色谱－质谱联用（GC－MS）等技术，从不同诱导处理水稻植株（机械损伤、褐飞虱危害（具刺吸式口器）、斜纹夜蛾危害（具咀嚼式口器）及健康植株中分离鉴定了16种挥发性物质，不同处理水稻挥发物化学成分与含量有明显差别，受斜纹夜蛾伤害的水稻，其挥发物的含量与种类最多，其次为受褐飞虱伤害3和5d的植株，健康植株、机械损伤植株以及受褐飞虱伤害1和2d的水稻植株的挥发物种类少且含量低，在双向选择实验中，褐飞虱对健康植株、机械损伤植株以及褐 飞虱危害植株的定向选择行为无显著差异，斜纹夜蛾诱导的水稻挥发物对褐飞虱具有明显的拒避作用。     

利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的

利用低温电镜术和像重构方法测定了兔出血症病毒的三维结构,分辨率达到3.2nm.兔出血症病毒的三维结构显示了杯状病毒的典型特征.位于二十面体二次轴和局域二次轴位置的90个弧状突起以及位于五和三次轴位置的32个杯状凹陷排布在T=3的二十面体衣壳上.因而从结构上表明中国株兔出血症病毒属于杯状病毒科.A,B壳粒之间相互连接,并且杯状凹陷底部未见隆起.兔出血症病毒衣壳壳层区由连续蛋白密度构成,未发现病毒RNA通道存在.从低温电镜像及三维密度图中可以分辨含基因组和含亚基因组两种病毒颗粒的存在.这两种病毒颗粒衣壳结构类似.     

飞虱虫疠霉黍米培养及其生物学特性

采用黍米(Panicum miliaceum)作为营养基质, 对侵染飞虱、叶蝉及蚜虫的飞虱虫疠霉(Pandora delphacis)进行固体培养实验. 将菌丝生物量约为25 mg/mL的菌丝液按20%的比例(体积重量比)接入经高温湿热灭菌而适度熟化、 含水量为45%的黍米中, 在25℃和12L︰12D条件下直接培养, 所获3~17 d黍米培养物的产孢潜能和有效产孢时间因培养天数不同而异. 以培养5 d的黍米产孢量最大, 达(17.12±1.31) ´ 10⁴个/粒, 培养7~11 d的黍米产孢量为13.00 ´ 10^{444Myzus persicae)成蚜暴露在黍米培养物中2 h后接种, 7 d内的感病死亡率为69.8%, 而对照蚜虫中无一染病死亡. 结果表明, 飞虱虫疠霉黍米培养物的生物学性状类似于该菌侵染致死的蚜尸, 而且每颗米粒的产孢潜能和有效产孢时间远优于天然蚜尸, 可作为虫霉病传播源而成为天然虫尸的模拟物.}     

从云南分离的烟草曲顶病毒为菜豆金色花叶病毒属的一个新种

从我国云南省保山地区烟草上表现曲顶症状的植株上分离获得病毒分离物Y1，经粉虱传毒及粒子形态观察，证明为菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒，用14种单克隆抗体进行三抗体夹心ELISA测定，结果表明Y1与我国及巴基斯坦、印度等国报道的双生病毒的抗原表位型均不同，对Y1基因组DNA-A的全序列进行了分析，全长2746个核苷酸，其中病毒链含有两个ORF，互补链含有4个ORF，Y1与其他双生病毒基因组DNA-A全序列、基因间隔区序列及各ORF编码的氨基酸序列的比较分析表明，Y1是一种新的Begomovirus病毒，定名为烟草曲顶病毒，英文名为Tobacco curly top virus，简称TCTV，TCTV全基因组与印度报道的番茄曲叶病毒和番木瓜曲叶病毒的同源性最高，达85%，而其CP基因与巴基斯坦棉花曲叶病毒分离物72b高度同源，氨基酸水平的同源性达98%。     

传染性喉气管炎病毒糖蛋白G基因的原核表达、细胞定位及功能研究

克隆测定了传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京E3和Zhonghai毒株的糖蛋白G基因(gG)序列, 并与多种动物的Ⅰ型α-疱疹病毒gG基因序列作了比对. 通过克隆gG基因至原核表达载体pET30a(+)构建pET30a-gG质粒, IPTG诱导表达含pET30a-gG重组质粒的阳性宿主菌后, 分离纯化得到分子量约35 kD的His-GG融合蛋白. 利用该融合蛋白制备的纯化的抗His-GG大鼠多抗血清, 观测ILTV糖蛋白G的在细胞上的分布, 发现糖蛋白G主要存在于宿主细胞的细胞核外周及细胞膜上, 在散在细胞内的分布较为分散, 而在融合细胞的结合部位分布较为集中. 利用抗体中和病毒糖蛋白G的实验结果表明, 糖蛋白G可能参与病毒从细胞到细胞的直接感染(CTCS), 从而影响病毒复制和噬斑的形成.     

茉莉酸信号传导途径参与了水稻的虫害诱导防御过程

采用RT-PCR的方法, 对茉莉酸信号传导途径在水稻虫害诱导防御中的作用进行研究. 结果表明, 斜纹夜蛾危害能够明显诱导水稻茉莉酸合成途径的关键酶脂氧合酶和丙二烯氧化物合成酶基因的表达, 而且外源茉莉酸处理和斜纹夜蛾危害对脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶以及蛋白酶抑制剂等水稻虫害防御基因的表达有相同(似)的诱导作用, 表明斜纹夜蛾危害可能会诱导水稻启动茉莉酸信号传导途径, 从而使水稻产生诱导防御机制. 虽然机械损伤和褐飞虱危害对脂氧合酶基因的表达有一定诱导作用, 但对丙二烯氧化物合成酶的表达无明显影响. 然而, 褐飞虱危害对水稻防御基因PR-1a和几丁质酶等病原相关蛋白以及水杨酸生物合成途径的关键酶苯丙氨酸转氨酶有不同程度的诱导作用, 说明褐飞虱危害可能启动了水稻水杨酸或其他信号传导途径从而产生诱导防御作用.     

Allexivirus属的一个新成员——大蒜病毒E的基因组全序列测定和系统树分析

测定了一个从浙江余杭大蒜中分离到的Allexivirus属成员的基因组全序列，单链正性病毒基因组含8451个核苷酸，6个ORF，与其他Allexivirus属成员的基因组全序列的核苷酸同源性仅为62.8%～64.8%；ORF1～ORF6编码蛋白的氨基酸同源性分别为67.6%～78.5%，55.4～66.2%，56.7%～66.4%，40.3%～55.6%，66.3%～79.9%和52.2%～68.8%，进一步分析显示，此病毒与其他病毒的差异和该属中远缘病毒间的差异相似，外壳蛋白核心区域氨基酸序列同源性仅为63.9%～79.8%，远低于该属不同病毒的国际分类标准，应归类为Allexivirus属的新成员，命名为大蒜病毒E，病毒不同编码蛋白序列的进化树分析也进一步证明了该病毒与其他病毒的亲缘关系。     

蓖麻蚕卵壳的偏光显微镜研究

昆虫的卵壳,是滤泡细胞所分泌的卵壳蛋白,依次沉积于卵母细胞外面,凝聚固化而成的。当卵壳沉积完成时,卵母细胞就被完整的卵壳包被起来,卵壳的表面则由滤泡细胞的内表面压印成特定的依种类而各异的花纹结构特征,在卵面上形成受精孔区和在卵面其他部分形成气孔分布特征。近年来对一些昆虫种类的卵壳表面结构进行了光镜和扫描电镜观察,但