水蛭素-RGD序列融合蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达(简报)

水蛭素是从医用水蛭唾液腺中分离纯化的一种多肽,分子量约为7 kD．它是天然存在的最专一有效的凝血酶抑制剂,无明显毒副作用,用量低,因此可作为抗栓药物用于治疗血栓性疾病．RGD 序列是纤维蛋白原等粘附因子上以 Arg-Gly-Asp 为核心的小肽序列,通过与活化血小板上纤维蛋白原受体 GPⅡb/ Ⅲa 结合而导致血小板聚集．因此外源 RGD 序列可通过竞争性结合该受体而阻断血小板的聚集,抑制血栓的形成．RGD 序列与水蛭素融合可获得同时具有抗凝血酶和抗血小板聚集双功能的新型抗栓剂．本文首次报道重组水蛭素 HV3与 RGD 序列融合蛋白基因克隆并在枯草芽孢杆菌中表达的结果．     

含RGD序列水蛭素嵌合抗栓剂的构建与表达

通过对水蛭素及一些含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的多肽类血小板聚集抑制剂结构与功能的分析,设计并构建了两个在水蛭素C端融合RGD序列的嵌合分子。嵌合体基因分别重组到表达载体pET-21a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经限制酶消化和DNA序列分析,证明两种重组质粒与设计完全一致。由于RGD-水蛭素嵌合基因上游连接了金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的信号肽序列,在IPTG诱导下两种嵌合分子都获得了分泌表达,表达产物主要集中在细胞周质空间。通过离子交换层析和凝胶过滤层分别对两种嵌合体蛋白进行纯化,纯化产物在Tricine-SDS-PAGE中都显示为单一条带。活性分析结果表明两种嵌合体蛋白在保留水蛭素抗凝血酶活力的同时,还呈现抗血小板聚集活性。     

KGD环七肽的分子设计及性质研究

通过化学合成方法合成线性长度七肽分子CKGDWDC,进而通过在(1,7)位形成二硫键构成共价闭合环状结构,最终形成KGD环七肽.结构计算结果显示,KGD环七肽中的KGD序列表现出功能构象,具有较强的抗血小板聚集活性,能够专一性识别与结合血小板膜上纤原受体,具有较强的抑制血栓形成的能力.KGD环七肽具有较强的实际应用价值和广阔的应用前景.     

关于(A6,A11)-双位点突变胰岛素原作为外源肽呈递骨架可行性的研究

通过重组DNA技术,以(A6,A11)-双突变胰岛素原分子为支架构建了含有外源抗栓肽功能区的嵌合分子,并在大肠杆菌进行了表达和纯化.对嵌合分子进行胰岛素受体结合活性、放射免疫活性及抗血小板聚集活性分析,结果表明该嵌合分子具有较强的血小板聚集抑制活性,而无胰岛素生物活性,证明以(A6,A11)-双突变胰岛素原作为外源肽序列呈递骨架是可行的.     

安舒克栓酶和水蛭素融合基因在枯草杆菌中的表达(简报)

安舒克栓酶(Antithromboase,AT)是本实验室从枯草杆菌N18中分离得到的具有强烈水解纤维蛋白活性的蛋白酶.研究表明,该酶具有直接纤溶和纤溶酶原激活剂的双重作用,且有较强的纤维蛋白亲和性,是极具开发价值的溶栓药物.来源于医用水蛭的水蛭素(hirudin,Hir)是凝血酶的最强有力的天然抑制剂,是极具优势的抗凝药物.但仍各有不足:安舒克栓酶只有溶栓功能,不能抗栓,不能解决血栓治疗中再栓塞的问题;水蛭素只有抗凝作用,不具溶栓功能.如果将这两种从不同途径治疗血栓的药物.通过融合     

利用含RGD的多肽增进细胞摄取用于细胞中弗林酶活性的检测

设计并合成了一种新型自组装多肽纳米荧光探针.在合成方法上使用了新型的生物兼容性的CBT-Cys点击反应实现了RGD肽的环化.该探针可通过RGD序列靶向肿瘤细胞αvβ3整合素受体,促进细胞的摄取;同时可与细胞内弗林酶作用导致荧光的"关-开",达到对肿瘤细胞的靶向荧光成像功能.     

水蛭素基因的递归PCR合成和在大肠杆菌中的表达与分泌

水蛭素是凝血酶最强的特异抑制剂，可望成为预防和治疗各种血栓疾病的有效药物。根据医用水蛭头部水蛭素（ＨＶ－２）的氨基酸序列，通过递归ＰＣＲ，合成水蛭素基因，并重组到本实验室改建的大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－＝ｏｍｐＡ－ＨＩ中，使水蛭素基因的编码序列直接位于大肠杆菌外膜蛋白Ａ信号肽序列的下游。转化大肠杆菌ＤＨ５α，筛选出重组体，经ＰＣＲ，限制酶切图谱和序列分析，结果表明所合成的水蛭素基因与设计完全一     

血小板聚集功能临床应用进展

血小板具有凝血和止血的功能.血小板聚集率在一定程度上能预示患者的出血风险,故对患者进行血小板功能试验的检测对临床治疗和患者出血风险评估方面有着重要的意义.血小板聚集功能的测定对于临床上诊断出血性疾病、血栓前状态、血栓性疾病及抗血小板药物监测方面具有重要意义.血小板聚集率检测在血液病、心内科疾病、神经内科疾病、内分泌科疾病及其并发症的预防、抗凝药物的监测、疾病辅助诊断和预后发挥着积极的作用.因此开展血小板聚集功能检测技术是临床不可缺少的项目之一.     

红花黄色素抗凝血作用及对血小板聚集影响的研究

目的研究红花黄色素抗凝血作用及对血小板聚集的影响。方法大鼠心脏采血,取血浆检测凝血酶原时间(PT),凝血酶时间(TT),活化部分凝血活酶时间(APTT),血浆纤维蛋白原(Fib)含量;家兔颈动脉采血,取富血小板血浆(PRP)及穷血小板血浆(PPP),描记聚集曲线,计算聚集百分率,最大聚集百分率及药物的聚集抑制百分率。结果红花黄色素明显延长大鼠血浆凝血酶时间、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间,明显降低大鼠血浆纤维蛋白原含量,显著抑制由二磷酸腺苷引起的家兔血小板聚集。结论红花黄色素具有抗凝血作用。     

水蛭素基因植物表达载体的构建

在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下,根椐植物基因密码子选择偏向,对水蛭素基因序列进行了改造．在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、poly(A)尾、XbaⅠ和SacⅠ双酶切位点．将所合成序列与双元载体pBI121重组,构建成pBI121-hir植物高效表达载体．经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3种方法鉴定,该载体构建成功．