高赖氨酸含量基因在转基因小麦的表达

构建了含高赖氨酸含量基因(wblrp)和赖氨酸合成关键酶(dapA)基因的植物表达载体pBPC102, 用基因枪导入京花1号、京411、优899和烟农15等受体品种的幼穗和幼胚, 获得了100多株转基因小麦植株(T₀)及其后代株系(T₁~T₂). PCR和PCR-Southern杂交结果表明, 外源基因已稳定整合到转化植株T₀和T₁的基因组中. 进一步用RNA分子杂交的方法对高赖氨酸基因的表达及水平调控进行了深入研究, 结果表明外源基因已在T₂不同株系中获得了表达. 植株叶片游离赖氨酸(Lys)含量和种子结合态Lys含量的测定和分析结果表明, 有9个转基因植株后代株系叶片的游离Lys含量提高了2~3倍, 4个株系的Lys含量提高了10%以上, 小麦的营养品质得到了显著的改善.     

抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的获得及病毒诱导的基因沉默

利用Act1启动子和除草剂选择标记bar基因，构建了含有小麦黄花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体，采用基因枪法导和小麦品系，经PCR和PCR－RFLP对转基因小麦T0代及T1代进行检测后，对阳性植株的后代株系（T2代）进行田间抗病性检测。结果表明，外源基因可以在后代中遗传，并且其中一个转基因株系的后代(P8-T2)对小麦黄花叶病毒呈现高度抗性，经Westernblot和RT－PCR检测发现，抗病转基因小麦体内外壳蛋白基因在病毒感染后的表达水平出现明显下降，认为所获得转基因小麦的抗性是由病毒诱导的基因沉默引起的。     

优质HMW谷蛋白亚基转基因小麦的获得及其遗传稳定性和品质性状分析

利用编码除草剂PPT抗性的bar基因作为选择标记, 构建了含有优质HMW谷蛋白亚基1Dx5和1Dy10基因的植物表达载体pBPC30, 用基因枪导入京花1号、京411号和京冬6号等受体品种的幼胚和幼穗, 获得了一批转基因小麦植株(T₀)及其后代株系(T₁～T₅). PCR, 点杂交和Southern杂交鉴定表明, 外源基因已整合到转化植株T₀的基因组, 并稳定表达. 转基因植株T₁代能抗20～80 mg/L的PPT, 其中1株抗性超过150 mg/L. 经SDS-PAGE分析表明, 外源1Dx5和1Dy10基因在T₂代不同株系中获得了表达. 转基因系TG3-74缺失了亚基8, 但亚基2, 5, 10和12都表达, 同时出现了一个新的亚基位于亚基7与原有亚基8之间(暂记为8^*). 品质分析结果表明, 有5个株系的Zeleny沉淀值为44.2～49.0 mL, 与对照CNN(48.0 mL)相当, 分别比京花1号(26.9 mL)和京冬6号(30.7 mL)提高了59.6% ~ 64.3%. T₅代株系的粉质曲线稳定时间比受体品种(3～7 min)大幅增长, 转基因株系TG5-23b的稳定时间为16 min, TG1-28d, TG3-76b, TG5-98和TG5-99的面团稳定时间高达30 min以上.     

抑制4CL基因表达获得低木质素含量的转基因毛白杨

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将反义4CL(4-coumarate:CoA ligase, 4-香豆酸辅酶A连接酶)基因转入三倍体毛白杨(Populus tomentosa). PCR及Southern检测证实外源基因已整合到转基因植株总基因组中. RT-PCR和Western检测表明反义4CL基因在转基因植物体内已表达. Klason木质素含量测定结果显示, 抑制内源4CL基因的表达可显著降低转基因株系的木质素含量, 比非转基因对照下降最高达41.73%. 但综纤维素含量测定结果表明, 转基因植株与对照没有明显区别, 推测4CL可能并非木质素与碳水化合物的代谢调节点. 转基因植株茎杆剥皮后呈现程度不等的红褐色, 而对照为白色, 其他生长发育特征与对照无明显差异. Wiesner反应结果表明, 木质素含量下降的株系呈红色, 而对照呈典型紫红色.     

表达雪花莲凝集素(GNA)的转基因水稻纯系抗褐飞虱

利用基因枪法将含有潮霉素抗性基因pht,gusA报告基因和雪花莲外源凝集素基因gna的2个质粒（pWRG1515和pRSSGNA1)共转化粳稻品种鄂宜105号和鄂晚5号种子胚诱导的愈伤组织。从轰击的329块愈伤中共再生出61株独立转基因植株。PCR／Southern blot分析显示，79％的转基因植株含有所有3个外源基因。Western blot分析发现，48株含gna基因的转基因植株中有36株（75％）在不同水平上表达了GNA，GNA最高表达量占总可溶性蛋白的0．5％，遗传分析证实外源基因在转基因后代植株中大多以孟德尔方式遗传。从其R1代为3：1孟德尔分离方式遗传的后代R2代植株中，鉴定出含有并表达所有3个外源基因的5个独立转基因植株纯系。褐飞虱生物鉴定和喂养试验表明，转基因纯系对褐飞虱具有显著的抑制作用，具体表现为降低褐飞虱存活率和繁殖力、延缓褐飞虱发育进度及减少褐飞虱进食量，即表达GNA的转基因水稻纯系对褐飞虱具有抗性作用。     

抑制衰老的嵌合基因在水稻中的转化

利用基因枪法把带有特异衰老基因ＳＡＧ１２启动子的ＩＰＴ基因导入水稻,经ＰＣＲ,点杂交以及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,证明外源基因已整合到水稻基因组中,通过ＧＵＳ活性细胞分裂素含量的分析以及Ｔ１代转基因植株成熟期的形态观察,证明此抑制衰老的自我调节系统在部分转基因水稻中表达,叶片衰老受到明显的抑制。     

通过叶绿体基因工程在烟草中合成中长链羟基脂肪酸聚酯

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs)属于微生物聚酯. PHA合酶(PHA synthase, 由phaC基因编码)和3-羟酰基-酰基转移蛋白-辅酶A转移酶(3-hydroxyacyl-acyl carrier protein-coenzyme A transferase, 由phaG基因编码)是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶. 以aadA(氨基糖苷-3′-磷酸转移酶)基因做筛选标记, 分别构建了含phaC2基因的单价叶绿体转化表达载体pTC2以及同时嵌合phaC和phaG基因的双价叶绿体转化表达载体pTGC. 通过PDS1000/He基因枪转化法转化烟草, 获得具有壮观霉素抗性的叶绿体型转基因烟草植株, PCR和Southern Blot结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中且基本达到同质化. 气相色谱法检测转基因株系中的mcl-PHAs含量最高达4.8 mg/g干重, 合成的PHAs单体主要成分为3-羟基辛酸(3-hydroxyoctanoate, 3-HO)和3-羟基癸酸(3-dydroxydecanoate, 3-HD). 透射电子显微镜观察到转基因烟草叶片叶绿体中确有PHAs颗粒累积.     

利用安全性转基因技术导入反义蜡质基因降低稻米直链淀粉含量

利用安全性转基因技术中的共转化法, 将分别含有p13W₄双元载体(含有潮霉素抗性基因、gus报告基因以及反义蜡质基因片段)和p13W₈双元载体(无潮霉素抗性基因和gus报告基因, 只含有反义蜡质基因片段)的根癌农杆菌以1:9的比例混合导入超2-10高产水稻新品系中, 获得34棵转基因植株. PCR分析转基因T₀代植株, 结果显示, 有15株是共转化植株, 共转化率为44.1%. 利用p13W4双元载体上的gus报告基因从T₁代种子中淘汰具有报告基因及抗性标记基因的转基因后代, 再利用PCR检测从T₁代植株中获得只有反义蜡质基因的植株. Southern blot杂交分析证实, p13W₈双元载体T-DNA已整合进入无抗性标记及报告基因的转基因后代基因组中. T₂代成熟种子直链淀粉含量分析显示, 转基因植株糙米直链淀粉含量比对照有不同程度的下降, 幅度最大的比对照降低28.61%. 由于获得的转基因后代只有目的基因而无抗性选择标记基因和报告基因, 而且水稻中的稻米直链淀粉含量已降低, 它们既可被用于筛选软米材料, 也可视为是能够用于其他水稻稻米食味品质改良的水稻新资源.     

通过叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因

构建了含phbB, phbA, phbC和aadA基因表达盒的叶绿体整合及表达载体, 通过基因枪轰击法转化烟草. 对具壮观霉素抗性的植株进行PCR和Southern等分析, 确证外源基因已整合到叶绿体基因组中, 同时测定了其同质化程度. Northern点杂交、RT-PCR分析结果表明, 叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因, 并且未观察到基因沉默现象. 叶绿体型转基因植株还具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点, 表明叶绿体基因工程在转基因植物生产聚3-羟基丁酸酯(PHB)方面极具潜力.     

花青素合成转录因子基因在玉米中的表达研究:一种新型基因可视化跟踪表达系统

花青素是一种水溶性的黄酮类物质,可使植物呈现出红、蓝、紫和红紫等颜色.外源花青素代谢调控基因的表达可使花青素在植物细胞内积累,使植物体外观上表现出色彩的变化,易于观察,因此可作为报告基因用于植物转基因研究,快速报告细胞、组织、器官或植株是否被转化.本研究用花青素代谢调控基因Bi和C1作为报告基因,以epsp作为筛选标记基因,构建了植物表达载体pBAC9009.基因枪转化玉米自交系501的幼胚,经过除草剂草甘膦抗性筛选和分化再生,获得了转化再生植株75株,其中43株获得结实种子.T0代植株有18株在苗期或生长阶段表现局部或全紫色,8个结实果穗有零星的紫色种子,从外观上可直接确认为转化植株.结合PCR和RT-PCR的分子检测及花青素含量分析,表明叶片和籽粒为紫色的玉米植株中外源目的基因已整合并且高效表达,即紫色表型与分子检测的结果高度一致.该结果表明我们成功建立了以花青素基因作为报告基因的植物转基因可视化跟踪表达系统.该系统的应用可以大大提高工作效率,节约检测成本,对于植物转基因研究具有重要意义.     

抑制COMT与CCoAOMT调控植物木质素的生物合成

咖啡酸-3-O-甲基转移酶（COMT）与咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶（CCoAOMT）基因分别编码植物木质素生物合成中不同底物水平的甲基化酶,构建了它们的单价与双价反义表达载体,并用农杆茵介导转化烟草.PCR-Southern检测表明外源基因已整合到烟草基因组DNA中;Northern点杂交结果表明外源基因在烟草中以转录水平表达.对表达单个及两个甲基化酶反义基因的成熟转基因植株的木质素含量测定结果表明,反义抑制COMT与CCoAOMT的表达均使转基因植株的木质素含量下降,但单独抑制CCoAOMT表达引起的下降幅度明显大于COMT,并且两个基因同时被抑制时,降低幅度更大,说明它们具有协同效应.组织化学染色结果说明COMT被抑制引起紫丁香基（S）木质素显著减少.上述结果表明,抑制植物内源CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成及改良造纸资源植物的有效途径.     

抑制COM与CCoAOMT调控植物木质素的生物合成

咖啡酸－3－O－甲基转移酶（COMT）与咖啡酰辅酶A－3－O－甲基转移酶（CCoAOMT）基因分别编码植物木质素生物合成中不同底物水平的甲基化酶，构建了它们的单价与双价反义表达载体，并用农杆菌介导转化烟草。PCR－Southern检测表明外源基因已整合到烟草基因组DNA中；Northern点杂交结果表明外源基因在烟草中以转录水平表达。对表达单个及两个甲基化反义基因的成熟转基因植株的木质素含量测定结果表明，反义抑制COMT与CCoAOMT的表达均使转基因植株的木质素含量下降，但单独抑制CCoAOMT表达引起的下降幅度明显大于COMT，并且两个基因同时被抑制时，降低幅度更大，说明它们具有协同效应，组织化学染色结果表明COMT被抑制引起紫丁香基（S）木质素显著减少。上述结果表明，抑制植物内源CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成及改良造纸资源植物的有效途径。     

转OsNHX1基因耐盐84K杨的培育

采用农杆菌介导的方法将水稻Na+/H+反向转运器基因OsNHX1导入84K杨, 获得3株抗性转化植株, PCR, Southern 和Northern检测结果表明, OsNHX1基因已经整合到84K杨基因组中, 并可以稳定表达. 耐盐实验表明, 3个株系的转基因植株能在200 mmol/L NaCl条件下正常生长. 对盐胁迫处理的转基因植株进行Na+含量和渗透势测定, 发现转基因植株叶片中的Na+明显高于对照植株, 其渗透势明显低于对照植株. 分子检测和耐盐性实验表明OsNHX1基因的转化获得成功, 并获得84K杨耐盐转基因 植株.     

玉米C4 型pepc基因的分子克隆及其在小麦的转基因研究

通过LA-PCR方法，从当地玉米材料中获得了完整的玉米C₄ 型pepc基因。测序结果与GenBank中登录的玉米C₄ 型pepc基因序列进行比对分析表明，DNA序列的同源性达98.96%，mRNA同源性达99.38%，蛋白质的氨基酸序列同源性达99.38%，在DNA水平，两者之间有49处碱基差异， 18处发生在内含子区，18处发生在外显子处。在mRNA水平，两者之间有15处差异，但是这些差异在蛋白质水平上仅导致了4个非连续排列的氨基酸差异。构建了该基因的农杆菌二元表达载体pBAC214。通过PDS/1000He基因枪转化法，获得了该基因的转基因小麦。对转基因小麦进行的Southern杂交，结果表明来自玉米的鉴定pepc基因完全整合到了小麦基因组中。通过对转基因小麦叶片的可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳分析，表明该基因在小麦中获得了正确的转录、剪接和翻译。通过对转基因小麦叶片中PEPC酶活性的初步测定，发现部分转基因植株叶片中PEPC酶活性提高了3-5倍，与玉米叶片中的PEPC活性相当。对转基因小麦旗叶光和生理指标的测定，发现部分转基因植株光合速率有所提高，并且气孔的开放程度与叶片中的PEPC活性紧密相关。说明完整的玉米C₄ 型pepc基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。     

通过叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯

构建了含phbB,phbA,phbC和ααdA基因表达盒的叶绿体整合及表达载体，通过基因枪轰击法转化烟草，对具壮观霉素抗性的植株进行PCR和Southern等分析，确证外源基因已整合到叶绿体基因组中，同时测定了其同质化程度。Northern点杂交、RT－PCR分析结果表明，叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因，并且未观察到基因沉默现象，叶绿体型转基因植株还具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点，表明叶绿体基因工程在转基因植物生产聚－3－羟基本丁酸酯(PHB）方面极具潜力。     

用PEG法向小麦原生质体导入外源基因获得转基因植株

目前用基因工程方法改良小麦是世界上普遍关注的课题,但其有效外源基因转化系统的建立却十分困难.Vasil 等曾用基因枪法转化小麦悬浮细胞获得转化的愈伤组织;最近他们又用相同的方法转化小麦胚性愈伤组织得到了抗除草剂的小麦转基因植株.我们在小麦原生质体再生植株获得成功的基础上,通过反复实验,用 PEG 处理法将外源基因导入小麦原生质体,通过培养和对转化细胞的筛选,获得了完整的转基因小麦再生植株.     

DNA甲基化对转基因表达的影响

DNA甲基化在调节真核生物基因表达过程中起着十分重要的作用。在植物转基因研究中，外源DNA甲基化往往易导致外源目的基因失活。利用农杆菌介导将β-葡糖醛酸酶基因（uidA)导入烟草，发现外源uidA基因在部分转基因植株中发生了基因失活现象。Northern杂交实验证实，基因失活的植株内检测不到外源uidA基因的转录产物，同时伴随着基因上游启动子区域的DNA甲基化现象。上述实验结果提示，转基因失活很可能是由于启动子区域甲基化引起的。     

抑制表达谷氨酰胺合成酶基因对水稻氮代谢和生长发育的影响

从明恢63平衡化cDNA文库中获得水稻GS2基因的cDNA克隆, 通过基因克隆和农杆菌介导的水稻遗传转化方法将GS2基因导入中花11进行超量表达. 对获得的转基因植株进行生长表型和基因表达、生理生化指标测定与分析. 结果显示, T₁代转基因植株由于GS2的抑制表达出现黄化现象, 生长受到限制; 叶片叶绿素含量与GS2基因的表达量紧密相关; 植株中大多数氮代谢、叶绿素合成和光呼吸途径中相关基因表达量上升; 而植株的氮代谢水平下降, 包括GS活性、水溶性蛋白和氨基酸含量.     

利用土壤农杆菌将天花粉蛋白基因转入水稻植株并检测抗稻瘟病活性

通过土壤农杆菌方法将天花粉蛋白基因转化到水稻中, 获得了具有单拷贝外源基因插入和表达的水稻再生植株. 抗稻瘟病(Pyricularia oryzae)检测发现, 接病菌后1个月内转天花粉蛋白基因植株在发病时间、发病植株数、发病叶片、发病后的植株生长状况等各项指标上与对照的转GUS基因植株比较均有较大差异. 在去除高湿度的发病环境后, 转天花粉蛋白基因植株的生长情况也明显优于对照植株. 表明转基因水稻对稻瘟病侵害至少有明显的延迟发病抗性. 天花粉蛋白基因在水稻中的表达未发现对宿主植物生长有明显影响.     

基因枪转多基因库安托杨的获得

通过基因枪共转化方法将枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)、透明颤菌血红蛋白基因(vgb)、双价抗蛀干害虫基因(BtCry3A+OC-Ⅰ)、调节基因JERF36及报告基因NPTⅡ等外源基因导入库安托杨, 共获得25株抗性植株. PCR及Southern杂交结果表明, 外源基因已整合到库安托杨基因组中, 其中7株含有上述全部5个外源基因. BtCry3A ELISA实验表明, 上述7株库安托杨BtCry3A基因已得到表达. 且上述转基因植株在滨海盐碱地中生长良好.