抗栓胰岛素原钙调素重组融合蛋白表达条件的摸索

以无活性人胰岛素原突变体为分子支架,在C肽位置嵌合特异拮抗血小板GPⅡbⅢa受体的去整合素活性结构位点序列,构建嵌合人胰岛素原突变体.该突变体相对分子质量大小为7.0×103,与钙调素的C末端融合后形成新型重组融合蛋白质,相对分子质量为24.7×103.构建该重组融合蛋白质的大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,尝试在大肠杆菌表达体系中,对该重组融合蛋白质进行高效表达.结果表明,该重组融合蛋白质的表达率约占菌体全蛋白的30%,优化后的表达条件为25℃,50μmol.L-1诱导表达16 h.     

A链链内二硫键移位突变胰岛素原的构建与表达

采用定点突变技术,将人胰岛素原基因编码框中A11位氨基酸残基与A12位氨基酸残基进行了互换,构建了[CysA11Ser,SerA12Cys]人胰岛素原突变基因.在大肠杆菌原核表达系统中对突变体基因进行了表达,并对表达产物进行了变复性研究及初步的分离纯化,获得了具有稳定结构的突变体蛋白质,探讨了突变体A链链内二硫键的形成状况,为进一步深入揭示A链链内二硫键的角色与功能打下了基础.     

重组人胰岛素原在大肠杆菌中的可溶性表达

目前重组胰岛素主要用于糖尿病的治疗.通过大肠杆菌(E.coli)密码子优化,设计人胰岛素原基因,建立利用大肠杆菌表达可溶性重组胰岛素原的技术方法.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组质粒p His-Nus Ainsulin诱导表达的大肠杆菌可溶性表达融合蛋白His-Nus A-insulin.重组蛋白His-Nus A-insulin可溶性表达的最适条件为0.1,mmol/L IPTG作用下37,℃诱导4,h,重组蛋白产物经过Ni柱纯化、500,mmol/L咪唑洗脱,得到纯度较高的1.059,μg/μL的重组蛋白His-Nus A-insulin,重组蛋白His-Nus A-insulin经烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切作用后,获得可溶的人胰岛素原.     

(A11,A12)胰岛素原移位突变体的表征研究

将(CysA11Ser,SerA12Cys)人胰岛素原移位突变体基因克隆至高效表达质粒pET22b多克隆位点区,构建重组表达质粒pET-A112,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLys中进行了表达.表达产物存在于包涵体中,通过包涵体的分离及二硫键变复性,获得A6-A12二硫键突变型的胰岛素原突变体.SDS-PAGE电泳显示突变型胰岛素原的电泳迁移率与野生型胰岛素原基本相同.质谱检测表明,突变性胰岛素原的分子结构均一、纯度良好,氨基酸组成与理论值基本一致.以野生型人胰岛素原为对照进行的胰岛素受体试验及胰岛素放射免疫试验表明,A6-A12二硫键错接型胰岛素原突变体的受体结合活性和放免活性是野生型胰岛素原的11%与55%.     

人鼻病毒3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

人鼻病毒3C蛋白酶具有高特异性,且在低温条件下具有较高酶活,目前已被商品化.在大肠杆菌中利用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签可促进人鼻病毒3C蛋白酶的可溶性表达.将人鼻病毒3C蛋白酶的DNA编码序列克隆到pRK792载体上,然后导入到大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,获得MBP-LEVLFQGP-6x His-人鼻病毒3C蛋白酶融合蛋白,随后通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白.用该产物切割纯化的MBP-LEVLFQGP-6x His-木聚糖酶融合蛋白,可获得木聚糖酶并用底物平板检测其活性.实验结果表明人鼻病毒3C蛋白酶能够在大肠杆菌中表达,并且能特异性地在其底物识别序列进行切割,从而移除MBP标签,获得仅带有6x His的人鼻病毒3C蛋白酶.该酶可以特异性地去除木聚糖酶融合蛋白中的MBP标签,获得有活性的木聚糖酶.利用MBP标签能够促进人鼻病毒3C蛋白酶可溶性表达,且人鼻病毒3C蛋白酶的活性不受影响,有利于一些不稳定的蛋白在低温下的标签去除和纯化.     

GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签

利用基因工程的方法,以实验室保存的p MAL-C2X-NAP质粒为模板,PCR扩增NAP基因,构建重组质粒p GEX-NAP.重组质粒通过酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),再经IPTG低温诱导获得可溶性GST-NAP融合蛋白,最后利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂进行纯化,Prescission蛋白酶进行柱上切割去除GST标签.结果表明,p GEX-NAP重组质粒构建正确,在大肠杆菌中经IPTG低温诱导表达,可获得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST标签后,经Western Blot验证NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗体特异识别.     

重组抗栓人胰岛素基因工程菌高密度发酵研究

通过重组DNA技术构建抗栓人胰岛素突变体基因,并转化入大肠杆菌宿主菌,构建基因工程菌株.通过高密度发酵技术对重组菌株进行大规模培养.通过对培养条件包括温度、溶氧量、pH值、补料等的调整,达到最佳培养状态,进而获得高产量的重组大肠杆菌菌体.检测大量培养重组大肠杆菌的表达率,并对表达产物进行纯化与进一步的理化分析鉴定.     

一种新型天蚕素杂合肽AD和aFGF突变体融合蛋白S的构建及表达

目的：构建和表达一种带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD和人酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)突变体的融合蛋白S，在创伤皮肤表面应用时能自动裂解成有抗感染功能的天蚕素杂合肽AD和皮肤修复功能的aFGF突变体。方法：利用P(R技术分别扩增出带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD基因和aFGF突变体基因。再利用两作为模板，用PCR方法扩增出编码融合蛋白S的DNA。将该DNA片段插入到载体pPICZaA中，并利用电转法将质粒转入毕赤酵母smd1168中，Zeocin抗性筛选重组转化子。甲醇诱导72h，SDS-PAGE电泳检测融合蛋白S的表达，并用Western-blot杂交检测融合蛋白S的免疫原性。结果：筛选出的重组转化株在甲醇诱导后能表达相对分子质量约为19000的融合蛋白S，而该蛋白能与aFGF抗体产生免疫反应。结论：用PCR方法获得编码含凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD和aFGF突变体的融合蛋白SDNA，并在毕赤酵母中实现了表达。     

人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

研究目的：克隆表达人肠激酶轻链编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化．方法：从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的5个外显子基因片段,经过酶切、连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列;随后,将目的基因片段插入原核表达载体pBV220中,构建成融合型表达载体pBV—EKL,转化大肠杆菌BL21（DE3）,调节温度至42℃诱导重组蛋白表达;通过镍亲和层析纯化得到重组蛋白．结果：所表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析,相对表观分子质量约为31kDa,表达量占菌体总可溶蛋白量的46％;通过镍亲和层析纯化得到的重组蛋白经复性后显示出具有催化切割活性．结论：成功构建了能大量表达重组人肠激酶轻链的菌株,为进一步进行重组人肠激酶活性的研究及其在生产和医学方面的应用研究奠定了基础．     

热休克蛋白质DnaK的纯化及其二聚体性质研究

通过定点突变技术构建了两个DnaK蛋白质突变体,研究腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和腺苷二磷酸(ADP)条件对热休克蛋白质DnaK二聚体性质的影响.首先诱导表达DnaK蛋白质的两个突变体DnaK-A303C和DnaK-H541C,并采用硫酸镍亲和层析和阴离子交换层析对重组蛋白质进行纯化.对等量的DnaK蛋白质进行氧化交联处理,然后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测ATP、ADP对DnaK二聚体的影响.研究表明DnaK突变体在ADP的存在下以同二聚体的形式存在,但是在ATP条件下能够形成异二聚体.由此为深入认识热休克蛋白质两个亚基之间的协同作用提供了实验依据.