转大豆GmDREB基因增强小麦的耐旱及耐盐性

DREB(dehydration responsive element binding)转录因子通过调控下游多个抗逆相关基因表达, 有效提高植物的抗逆性. 利用酵母单杂交技术从大豆(Glycine max)品种吉农27的cDNA表达文库中克隆了一个新的GmDREB基因. 该基因编码174个氨基酸, 具有一个由58个氨基酸组成的AP2/EREBP保守域, 其中第14与第19位保守氨基酸分别是缬氨酸(V)与谷氨酸(E), 在N末端和C末端分别有一个核定位信号区和转录激活区. 利用玉米组成型启动子Ubiquitin和拟南芥诱导型启动子rd29A构建了植物表达载体, 通过基因枪转化小麦品种鲁麦22号, 获得103株T₀代再生植株, 通过PCR检测, 分别获得含Ubi::GmDREB和rd29A::GmDREB的转基因植株13株和11株. T₁代经过PCR, Southern blot, RT-PCR检测, 证明GmDREB基因已经整合到小麦基因组中, 并在转录水平上表达. 携带Ubi::GmDREB或rd29A::GmDREB转基因株系的T₁代植株苗期耐旱或耐盐性鉴定表明, 转基因小麦植株的耐旱或耐盐能力明显提高, 说明GmDREB基因在2种不同启动子驱动下均能有效提高转基因小麦的耐盐、耐旱性.     

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草.Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高.以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

大豆GmLlsl基因的克隆及表达调控分析

玉米的叶片坏死斑点(lethal leaf-spot 1,Lls1)基因及其拟南芥中的同功能基因已证明编码叶绿素分解代谢中的关键酶脱镁叶绿酸氧化酶(pheide a oxygenase,PaO)．为了深入研究大豆叶片衰老过程中叶绿素分解代谢的调控机制,从大豆中克隆了玉米Lls1的同源基因,其cDNA全长1817bp,命名为GmLls1(GenBank登录号：DQ154009)．序列分析表明,该基因与拟南芥、玉米、豇豆和番茄等的Lls1及其同功能基因具有很高的同源性,其编码蛋白含有典型的Rieske[2Fe-2S]结构域、非亚铁血红素铁结合域和C-末端CXXC基序,这些都是PaO功能蛋白所具有的典型结构特征．RT-PCR结果显示,在大豆叶片自然衰老、人工黑暗诱导衰老和子叶衰老3个系统中,GmLls1基因都表现出明显的衰老上调趋势．进一步分析发现,在因敲减类受体蛋白激酶rlpk2基因而导致衰老延缓的大豆转基因叶片中,GmLls1的表达显著下降,而在因过表达rlpk2而导致加速衰老的转基因叶片中,GmLls1的转录本积累明显增加,暗示RLPK2介导的信号途径可能参与调控GmLls1在大豆叶片衰老过程中的表达,而rlpk2-RNAi转基因离体叶片光照下表现出lls1突变体典型的斑状失绿坏死表型则进一步支持了上述推论．     

抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的获得及病毒诱导的基因沉默

利用Act1启动子和除草剂选择标记bar基因，构建了含有小麦黄花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体，采用基因枪法导和小麦品系，经PCR和PCR－RFLP对转基因小麦T0代及T1代进行检测后，对阳性植株的后代株系（T2代）进行田间抗病性检测。结果表明，外源基因可以在后代中遗传，并且其中一个转基因株系的后代(P8-T2)对小麦黄花叶病毒呈现高度抗性，经Westernblot和RT－PCR检测发现，抗病转基因小麦体内外壳蛋白基因在病毒感染后的表达水平出现明显下降，认为所获得转基因小麦的抗性是由病毒诱导的基因沉默引起的。     

利用绿色荧光蛋白研究大豆疫霉与大豆的互作

利用卵菌Bremia lactucae的hsp70启动子和ham34终止子序列, 将外源绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因转化进大豆疫霉. 利用荧光显微镜观察了gfp基因在大豆疫霉不同发育阶段的表达. 另外, 利用该报告基因系统观察了大豆疫霉在寄主大豆叶片、下胚轴和根部的侵染行为以及显微分析了不同抗性的大豆品种抗大豆疫病在根部的差异. 结果表明, gfp基因能够在大豆疫霉中稳定表达, 在菌丝、游动孢子囊、游动孢子、休止孢、卵孢子阶段都能够观察到绿色荧光; 以GFP作为标记可以实时地观察到大豆疫霉在寄主体内的侵染过程, 发现大豆疫霉在抗性大豆品种根部表面萌发的芽管明显长于在感病品种根部萌发的芽管长度. 结果表明, GFP可以作为大豆疫霉遗传研究中有价值的分子标记.     

从大豆疫霉菌ESTs中发掘SSR标记

通过对5800条大豆疫霉菌EST进行电子查询, 在369条EST中发现415个SSR. 在筛选的EST序列中SSR平均密度为每 8.9 kb含有1个SSR. 在鉴定的SSR中, 三核苷酸重复基元的SSR类型最多, 占鉴定总数的50.1%, 四核苷酸重复基元的SSR类型最少, 为8.2%. 设计40个SSR引物对对5个大豆疫霉菌菌株基因组DNA进行PCR扩增, 有33个引物对扩增出SSR特征条带, 其中有28个引物对扩增出在预期片段大小范围之内的条带. 在33个功能性引物对中, 有15个引物对在5个大豆疫霉菌菌株间扩增出多态性, 多态性引物对占45.5%. 基于SSR标记进行聚类分析, 可将5个检测大豆疫霉菌菌株划分为不同的3个组. 本研究建立了大豆疫霉菌的SSR标记, 为大豆疫霉菌及相关属种的鉴定、遗传变异、分子作图等研究提供了一种更加有效的分子标记系统.     

拟南芥防卫基因 PDF1.2启动子中GCC盒应答茉莉素反应必要的顺式作用元件

通过对PDF1.2启动子进行缺失突变和点突变,结合在烟草叶片中的农杆菌瞬时表达,分析了该启动子中应答茉莉素反应的必要顺式作用元件,验证了该基因上游1861 bp的区域具有应答茉莉素反应的功能.通过缺失突变证实了该启动子-300和-234 bp间的区域是该启动子应答茉莉素反应的重要区域.为了进一步阐明此重要区域中的应答茉莉素反应的必需区域,分别对此区域中的GCC盒、类G盒和一个回文序列进行了点突变.在烟草叶片中的瞬时表达分析表明,GCC盒的突变使该启动子丧失了对MeJA的应答,而类G盒和回文序列的突变没有明显的改变该启动子区域对茉莉素的反应,表明GCC盒是PDF1.2基因启动子中应答茉莉素反应的必需顺式作用元件.在此基础上,将含有4次重复GCC盒序列的片段与CaMV 35S的最小启动子序列构建成嵌合启动子.在烟草叶片中,该嵌合启动子可应答茉莉素的诱导反应,表明GCC盒是PDF1.2基因启动子中应答茉莉素反应必要的顺式作用元件.     

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草. Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm)基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高. 以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

利用人工控制细胞死亡策略培育抗稻瘟病水稻

利用细菌编码RNase的barnase 基因及其特异抑制剂编码基因barstar构成的双元组分系统, 把本实验室构建的具有稻瘟菌(Magnaporthe grisea)诱导活性的嵌合启动子与barnase基因融合, 再与由CaMV 35S启动子驱动的barstar的构件融合, 构建植物表达载体pWBNBS和pPBNBS, 转化水稻, 并对转基因水稻进行了抗稻瘟病和白叶枯病的检测. 结果表明, 接种稻瘟菌后, 转基因水稻植株中barnase基因受诱导表达; 在稻瘟菌侵染诱导下, barnase的表达超过barstar的抑制, 导致转基因水稻叶片出现类似过敏感应, 表现出对稻瘟病的抗性; 转基因水稻对白叶枯病表现出一定的抗性. 这些结果说明, 通过该双元组分系统策略获得的转基因水稻具有明显的抗致病性真菌和一定程度的抗细菌危害的较广谱抗性.     

大豆GmLls1基因的克隆及表达调控分析

玉米的叶片坏死斑点(lethal leaf-spot 1, Lls1)基因及其拟南芥中的同功能基因已证明编码叶绿素分解代谢中的关键酶脱镁叶绿酸氧化酶(pheide a oxygenase, PaO). 为了深入研究大豆叶片衰老过程中叶绿素分解代谢的调控机制, 从大豆中克隆了玉米Lls1的同源基因, 其cDNA全长1817 bp, 命名为GmLls1 (GenBank登录号: DQ154009). 序列分析表明, 该基因与拟南芥、玉米、豇豆和番茄等的Lls1及其同功能基因具有很高的同源性, 其编码蛋白含有典型的Rieske [2Fe-2S]结构域、非亚铁血红素铁结合域和C-末端CXXC基序, 这些都是PaO功能蛋白所具有的典型结构特征. RT-PCR结果显示, 在大豆叶片自然衰老、人工黑暗诱导衰老和子叶衰老3个系统中, GmLls1基因都表现出明显的衰老上调趋势. 进一步分析发现, 在因敲减类受体蛋白激酶rlpk2基因而导致衰老延缓的大豆转基因叶片中, GmLls1的表达显著下降, 而在因过表达rlpk2而导致加速衰老的转基因叶片中, GmLls1的转录本积累明显增加, 暗示RLPK2介导的信号途径可能参与调控GmLls1在大豆叶片衰老过程中的表达, 而rlpk2-RNAi转基因离体叶片光照下表现出lls1突变体典型的斑状失绿坏死表型则进一步支持了上述推论.     

拟南芥防卫基因PDF1.2启动子中GCC盒是应答茉莉素反应必要的顺式作用元件

通过对PDF1.2启动子进行缺失突变和点突变, 结合在烟草叶片中的农杆菌瞬时表达, 分析了该启动子中应答茉莉素反应的必要顺式作用元件, 验证了该基因上游1861 bp的区域具有应答茉莉素反应的功能. 通过缺失突变证实了该启动子-300和-234 bp间的区域是该启动子应答茉莉素反应的重要区域. 为了进一步阐明此重要区域中的应答茉莉素反应的必需区域, 分别对此区域中的GCC盒、类G盒和一个回文序列进行了点突变. 在烟草叶片中的瞬时表达分析表明, GCC盒的突变使该启动子丧失了对MeJA的应答, 而类G盒和回文序列的突变没有明显的改变该启动子区域对茉莉素的反应, 表明GCC盒是PDF1.2 基因启动子中应答茉莉素反应的必需顺式作用元件. 在此基础上, 将含有4次重复GCC盒序列的片段与CaMV 35S的最小启动子序列构建成嵌合启动子. 在烟草叶片中, 该嵌合启动子可应答茉莉素的诱导反应,表明GCC盒是PDF1.2 基因启动子中应答茉莉素反应必要的顺式作用元件.     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii))HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)固氮调节基因nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux的结瘤固氮效率有促进作用.首先构建一个带有Kp nifA的重组质粒pXD1,使nifA在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达.当质粒pXD1转移至大豆根瘤菌RfHN01lux后,获得带Kp nifA的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显提高,感染大豆幼苗后,大豆生物量的增加,如植株株高、植株鲜重、植株干重及大豆产量均优于原始出发菌.     

大豆转录因子GmWRKY57B的基因克隆及功能分析

WRKY类转录调控因子在高等植物中构成一个基因超家族, 它不但广泛参与了植物对非生物胁迫和生物胁迫的反应, 还参与了生长发育及多种代谢途径的调控. 本研究构建了一个大豆cDNA文库, 采用酵母单杂交的方法, 用来自AtNPR1启动子区的W-box对构建的大豆cDNA文库进行筛选, 获得了GmWRKY57B基因, 该基因全长1033 bp, 编码299个氨基酸, 属于WRKY类转录因子的第Ⅲ组; 酵母挽救实验及凝胶阻滞实验均表明, GmWRKY57B能够与W-box特异性结合; 酵母体内的转录激活实验表明, GmWRKY57B在酵母细胞中具有转录激活功能; GmWRKY57B在大豆根、茎、叶中均有表达; GmWRKY57B基因在烟草中的过表达能够提高转基因烟草植株的抗旱性, 表明GmWRKY57B 基因在非生物逆境中有一定的功能.     

转抗细胞凋亡基因p35黏虫细胞克隆株研究

通过脂质体介导的方法将抗细胞凋亡p35基因导入黏虫细胞系Ms7311, 经Zeocin抗性筛选和细胞克隆, 获得了转基因细胞株TMs7311. PCR检测证明, 转基因细胞株基因组DNA中含有p35基因特异扩增谱带. 该转基因细胞株形态与原始细胞系不同, 生长速度快, 群体倍增时间为25.4 h, 对磷酸缓冲液(PBS)有较强的营养抗性, 能抑制放线菌素D诱导的细胞凋亡; 病毒产量和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)以及碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase, SEAP)的表达水平明显高于原始细胞系Ms7311, 是一株高表达重组蛋白和高产杆状病毒的优良细胞株.     

大豆中NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定

植物抗病原克隆研究对于植物抗病育种和抗病机制的理解具有重要意义。根据预测结构域可将已知植物抗病基因分为4类，其中以NBS（nucleotide binding site)结构域为主。NBS结构域包括P环（激酶1a)、激酶2a和激酶3a。这为利用同源技术克隆植物抗病基因提供了可能。根据烟草抗花叶病毒N基因和拟南芥抗丁香假单孢杆菌RPS2基因设计兼并引物，从大豆抗花叶病毒品种科丰1号的基因组中扩增获得358个克隆，鉴定出4个能读的且与抗病基因NBS结构域同源的片段：KNBS1，KNBS2，KNBS3和KNBS4.Southern杂交表明NBS类抗病基因在大豆中为多拷贝家族；RFLP分析将KNBS4定位于F连锁群，而NBS2则与大豆抗花叶病毒基因Rsa的SCAR标记同位于J连锁群。Northern分析表明KNBS2类在大豆的根、茎和叶中为低丰度组成型表达，这为最终克隆大豆抗病基因打下了基础。     

中国和美国大豆疫霉群体遗传结构的RAPD比较分析

为探究中国和美国大豆疫霉的遗传关系, 采用随机扩增DNA多态性(RAPD)的方法, 对来自中国黑龙江省、福建省和美国的3个大豆疫霉地理群体的遗传多样性进行了分析. 通过使用21个RAPD引物对供试的111株大豆疫霉菌株进行扩增, 共得到223个RAPD标记, 其中多态性标记为199个, 占89.23%. 遗传变异分析表明, 美国群体具有更高的遗传变异度; Nei’s遗传相似性和主成分分析均显示, 中国福建群体与美国群体间的遗传相似性最高, 而福建群体与黑龙江群体间遗传相似性最低; 聚类分析显示, 供试菌株在88%的相似性水平上可被区分为7个聚类, 且美国群体分布于更多的聚类组中; Shannon-Wiener多样性指数也表明美国群体的遗传多样性最为丰富. 综合分析表明, 本研究的结果不支持关于美国的大豆疫霉可能来源于中国的推测.     

大豆灰斑病抗病基因RAPD标记的分子特征及抗、感种质的SCAR标记鉴定

与大豆灰斑病抗病基因连锁的共显性标记OPS03620&580的2个特征片段OPS03620和OPS03580的全序列分析表明,共显性分离的主要原因在于引物扩增区域内30 bp的插入(或缺失).Southern杂交显示,OPS03620来源于大豆基因组中的单拷贝或低拷贝序列,可用作RFLP探针.将RAPD标记转化成共显性的SCAR标记SCS3620&580.用SCS3620&580检测93株F2群体所得结果与RAPD标记检测结果相同,对62份大豆灰斑病抗感种质资源的测试显示,在绝大部分抗、感种质之间存在明显多态性.此标记兼具RFLP和RAPD的优点,在灰斑病抗病育种中具有广泛的应用价值.     

利用RNA干扰技术敲减rlpk2基因的表达可以延缓大豆叶片衰老

叶片衰老是受细胞内部遗传程序控制的、植物叶片发育过程的最后一个阶段, 对启动和调控这一过程的分子机制及衰老信号的传递途径的研究具有重要意义. 从人工诱导衰老的大豆叶片中克隆到一个新的LRR型类受体蛋白激酶基因rlpk2 (GenBank登录号: AY687391), 无论在前期人工诱导衰老系统还是叶片自然发育过程中, 该基因在大豆叶片中的表达水平都表现出明显的衰老上调趋势. 利用RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)“敲减”(knock-down)该基因的表达, 可以明显延缓转基因大豆叶片无论自然发育还是营养缺乏胁迫引起的衰老进程, 转基因植株叶片具有比较致密的表面结构及较高的叶绿素含量.     

多倍体山羊草物种中高分子量麦谷蛋白亚基的组成与其编码基因的分子克隆

山羊草属(Aegilops)是小麦属(Triticum)的近缘属之一, 山羊草属物种的种子中含有与普通小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW glutenin subunit)结构相似的贮藏蛋白, 通称为山羊草高分子量麦谷蛋白亚基. 利用SDS-PAGE分析了4种多倍体山羊草物种所含高分子量麦谷蛋白亚基的组成, 之后又通过比较各种PCR扩增方法, 以偏凸山羊草(Ae. ventricosa)为材料建立了从多倍体山羊草物种基因组中扩增高分子量麦谷蛋白亚基编码基因的有效方法. 目前已从偏凸山羊草中克隆了两个高分子量麦谷蛋白亚基的编码基因, 氨基酸序列分析表明这两个基因分别编码1个x型和1个y型亚基.     

利用安全性转基因技术导入反义蜡质基因降低稻米直链淀粉含量

利用安全性转基因技术中的共转化法, 将分别含有p13W₄双元载体(含有潮霉素抗性基因、gus报告基因以及反义蜡质基因片段)和p13W₈双元载体(无潮霉素抗性基因和gus报告基因, 只含有反义蜡质基因片段)的根癌农杆菌以1:9的比例混合导入超2-10高产水稻新品系中, 获得34棵转基因植株. PCR分析转基因T₀代植株, 结果显示, 有15株是共转化植株, 共转化率为44.1%. 利用p13W4双元载体上的gus报告基因从T₁代种子中淘汰具有报告基因及抗性标记基因的转基因后代, 再利用PCR检测从T₁代植株中获得只有反义蜡质基因的植株. Southern blot杂交分析证实, p13W₈双元载体T-DNA已整合进入无抗性标记及报告基因的转基因后代基因组中. T₂代成熟种子直链淀粉含量分析显示, 转基因植株糙米直链淀粉含量比对照有不同程度的下降, 幅度最大的比对照降低28.61%. 由于获得的转基因后代只有目的基因而无抗性选择标记基因和报告基因, 而且水稻中的稻米直链淀粉含量已降低, 它们既可被用于筛选软米材料, 也可视为是能够用于其他水稻稻米食味品质改良的水稻新资源.