拟南芥抗旱突变体的筛选和鉴定

文章采用不同浓度的甘露醇模拟干旱胁迫,以发芽率为筛选指标在拟南芥突变体库中筛选抗旱突变体,筛选出2株候选突变体,最终得到1株稳定突变体vem1,通过表型和生理生化鉴定,确定为抗旱突变体。该研究为抗旱基因克隆及功能分析奠定基础,对于揭示植物抗旱的分子机理具有重要的理论意义。     

一种适用于批量筛选和鉴定拟南芥突变体的快速DNA提取方法

DNA提取是拟南芥突变体筛选与鉴定中的关键环节.结合拟南芥突变体鉴定特点和DNA提取特点,对传统SDS法进行改良,摸索出一种简易、快速且经济的DNA提取方法,并将其应用到突变体的批量筛选与鉴定中.使用该方法可在常温下利用10mg左右拟南芥叶片,以少量试剂,通过简单的研磨、离心、沉降和干燥等步骤便能快速制备用于PCR检测的DNA模板.采用本方法个人提取单个样品DNA仅需15min左右,每小时可提取48个DNA样品.研究采用该方法提取了一批待鉴定拟南芥突变体的DNA样品,利用三引物法对其进行PCR检测,结果表明DNA样品浓度高,DNA扩增成功率高达100%,且目的条带清晰,说明该方法在拟南芥突变体的筛选和鉴定上是适用且高效的,可广泛应用于实验室突变体库的建立.     

一株拟南芥镉敏感突变体的筛选及表型分析

利用不同浓度梯度的CdCl2对拟南芥Col-0生态型进行处理,确定了筛选镉敏感突变体的适合浓度为90μmol/L.以镉对幼苗根长生长抑制程度为指标,对拟南芥化学诱导激活标签(XVE)T-DNA插入突变体库种子进行筛选.首先在不含有雌激素的1/2MS培养基进行大规模筛选,挑选根长抑制明显的植株,单株收取种子.在T3代复筛过程中用含有浓度为90μmol/L CdCl2的1/2 MS固体培养基筛选到一株敏感突变体csr-2.并进行了雌二醇诱导过表达表型验证.运用TAIL-PCR技术确定该植株的T-DNA插入位点位于At2g36130,并对该基因的序列进行了初步的生物信息学分析.     

一株拟南芥晚花突变体的分子分析

植物的开花时间直接控制植物营养生长期和生育期的长短,在相当程度上决定着繁育的成功与否,也与植物的产量和质量性状密切相关.拟南芥花期改变突变体是植物开花调控机制研究重要的植物材料.研究利用前期研究中获得的一株稳定遗传的、晚花表型的T-DNA插入拟南芥突变体pex2为材料,对其进行开花相关表型分析、T-DNA插入位点鉴定及插入位点基因转录分析等研究,结果表明:pex2突变体中存在单一的T-DNA插入,该插入位点位于PEX2基因下游约1 800 bp处,且该位点的插入引起了PEX2全长转录产物的缺失.该研究为进一步探索pex2突变体晚花机制及拟南芥PEX2基因与晚花表型之间的相关性研究,提供了研究材料.     

一株晚花和镉敏感拟南芥突变体的分离与鉴定

为了进一步挖掘拟南芥响应Cd胁迫的分子机制,从化学诱导型拟南芥突变体库(约6 000株系)中筛选获得Cd敏感突变体,通过测量经Cd处理后拟南芥植株的根长变化获得Cd响应突株系,然后单株收种并鉴定,最终获得一株对Cd胁迫敏感的突变体。Thermal asymmetric interlaced-PCR(TAIL-PCR)发现这株突变体T-DNA的插入定位于基因At1g35820和At1g35830之间。进一步分析表明这个突变体也是FLC(Flowering locus C)依赖的晚花突变体,将这株突变体命名为fcr(flowering and cadmium related gene)。FLC在拟南芥开花调控网络中起枢纽作用,并且是开花正调控基因Suppressor of overexpression of co 1 (SOCI)的抑制因子。在该突变体中FLC的表达明显高于野生型植株,而FLC下游基因SOCI的表达明显低于野生型植株,但FLC上游基因的表达变化不明显。进一步实验发现,突变体fcr中调节环境因素和春化作用的基因High expression of osmotically responsive gene 1(HOS1)表达量显著增加。通过以上结果我们推测,突变体fcr中的晚开花和Cd敏感表型可能是HOS1基因过量表达所致。     

dst6,拟南芥中一个可能的新的det2等位基因突变株

在黑暗条件下筛选拟南芥滞绿突变体时,得到一株突变体,dst6,表现出典型的油菜素突变体的特征．遗传分析表明其是单基因隐性突变．利用简单序列多态性标记,将其定位于2号染色体的底部．粗定位的结果和形态学特征表明dst6可能是一个det2等位基因突变株．通过对(dst6中DET2基因的测序分析,证明了dst6可能是一个新的det2等位基因突变株．     

拟南芥低光效突变体lpe1的筛选和特性分析

利用叶绿素荧光仪对化学诱变剂乙酰甲基磺酸(EMS)诱变的野生型拟南芥(Col-0生态型)F2代幼苗进行叶绿素荧光突变体筛选,获得了一株低光合效率突变体lpe1(low photosynthetic efficiency 1).遗传分析结果表明,lpe1是一个单基因隐性突变体.在生长发育的各个时期,lpe1叶片的叶绿素荧光值、叶绿素含量、淀粉含量和总蛋白含量明显低于野生型.     

拟南芥AtHHR2基因的功能初步研究

为了研究拟南芥Highly Homologous RING domain 2基因(At5g43200)在盐胁迫逆境的功能,通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T-DNA插入突变体athhr2,并通过根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得了athhr2/ATHHR2互补转基因株系.对突变体、互补转基因株系及野生型进行盐胁迫处理,对其萌发率、脯氨酸及叶绿素水平进行检测,发现盐处理后缺失突变体的萌发率降低,脯氨酸和叶绿素含量低于野生型,互补株系的萌发率、脯氨酸和叶绿素含量均高于野生型.以上结果证明AtHHR2基因在拟南芥的盐胁迫响应中起正调控作用.     

拟南芥锌指结构域ABRv1基因的功能研究

为了分析拟南芥脱落酸响应蛋白RING-V1基因(ABRv1)的功能,构建了高表达载体pBI121-ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1.通过DNA及RNA水平鉴定了ABRv1基因的T-DNA插入突变体abrv1.对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,突变体的萌发率不足10%,野生型萌发率为40%,而过表达株系萌发率为67%;突变体株系气孔几乎全部关闭,过表达株系气孔关闭不明显,大小是突变体株系的2~3倍.结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用.     

拟南芥盐敏感突变体EMS85的快速基因定位与分析

土壤盐碱化是造成农作物减产的主要原因.作者通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型种子Col-0进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变,筛选到1株盐敏感突变体EMS85.通过杂交和后代性状分离比确定该突变体的不耐盐性是受隐性单基因控制.采用图位克隆的方法,通过对拟南芥5条染色体上的SSLP标记的筛选,挑选了24对均匀分布于染色体上的SSLP标记作为基因初定位,同时设计了一系列精细定位分子标记,通过粗定位和精细定位发现,该基因位于拟南芥第5条染色体下臂的分子标记LUGSSLP847和5-13.58之间,进而测序结果表明该突变体是SOS2基因的等位突变体,突变位点为该基因1 521~1 522 bp处两碱基的缺失,造成移码突变,使SOS2基因功能丧失.本实验室建立的图位克隆体系加快了克隆基因的进程,对EMS85突变体的定位只在短短半年时间就已完成,为其他突变体的快速确定候选基因,加速基因分离进程奠定了基础.