拟南芥中一个参与盐胁迫应答基因的T-DNA插入纯合突变体的鉴定及表型分析

本研究以拟南芥为试验材料,探索基因at5g66070在受到非生物胁迫的表达情况,并研究其抗逆特性.结果表明,在NaCl处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到盐的诱导.通过PCR和RT-PCR在DNA和RNA水平上筛选鉴定at5g66070基因T-DNA插入纯合突变体.分析了野生型拟南芥与突变体在不同浓度NaCl处理下,其萌发率,根长以及苗期的生长差异.结果发现,相对于野生型来说,突变体对盐更敏感.具体来说,在含有150mMNaCl的MS培养基中,突变体的萌发率比野生型要低,根长比野生型要短,同时突变体幼苗更容易出现枯萎,萎黄症状.     

拟南芥At5g66070基因在ABA处理下的初步研究

本研究以拟南芥为实验材料,探索基因At5g66070在植物激素ABA处理条件下的相关生理功能.结果表明,在10μMABA处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到ABA的诱导.亚细胞定位发现AT5G66070定位在细胞核.通过DNA及RNA水平筛选鉴定At5g66070基因T-DNA插入纯合突变体,然后经根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得过表达转基因株系.表型分析发现经ABA处理后,突变体相对于野生型而言根长较短,表明突变体对ABA更为敏感.气孔关闭实验发现10μM ABA能诱导突变体气孔关闭,而野生型和过表达无显著影响.以上结果表明At5g66070在拟南芥的ABA胁迫响应中起负调控作用.     

一株拟南芥晚花突变体的分子分析

植物的开花时间直接控制植物营养生长期和生育期的长短,在相当程度上决定着繁育的成功与否,也与植物的产量和质量性状密切相关.拟南芥花期改变突变体是植物开花调控机制研究重要的植物材料.研究利用前期研究中获得的一株稳定遗传的、晚花表型的T-DNA插入拟南芥突变体pex2为材料,对其进行开花相关表型分析、T-DNA插入位点鉴定及插入位点基因转录分析等研究,结果表明:pex2突变体中存在单一的T-DNA插入,该插入位点位于PEX2基因下游约1 800 bp处,且该位点的插入引起了PEX2全长转录产物的缺失.该研究为进一步探索pex2突变体晚花机制及拟南芥PEX2基因与晚花表型之间的相关性研究,提供了研究材料.     

油菜突变体库构建与激素反应基因克隆分析

以优质高产的油菜品种1244W6为材料,采用浸花蕾方法,将含有激活标记和Basta筛选标记质粒pSKI015的农杆菌进行转化,成功构建了油菜激活标记突变体库.通过Basta筛选,结果共获得约30 000个转基因株系(T1代).将部分转基因株系种子(T2代)培养在不含任何激素、或含有不同浓度植物激素的营养液中,结果筛选出激素反应突变体63个,长下胚轴和短下胚轴突变体分别为15和13个.采用TAIL-PCR技术,克隆了W1016激素反应突变体T-DNA插入位点基因组旁邻序列.     

拟南芥网格蛋白重链突变体的遗传分析

利用PCR方法分离筛选了拟南芥网格蛋白重链T-DNA插入突变体chc1和chc2,并观察了CHC功能缺失后对植株发育的影响.结果表明：拟南芥网格蛋白重链CHC1或CHC2功能缺失引起部分植株发育异常,表现出生长素相关的发育表型,如幼苗子叶出现棒状、喇叭状和扇形等各种异常表型;通过人工杂交未能获得chc1chc2纯合双突变体,表明CHC1和CHC2功能同时缺失可能引起花粉致死或胚胎致死.这些遗传分析结果表明CHC在植物发育过程中具有重要的生物学功能.     

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。     

镉胁迫对Fibrillins突变体的生理影响

以拟南芥Columbia(Col.)生态型和Fibrillins突变体(fib8和fib1a)为研究对象,对镉胁迫条件下植株的萌发、根长生长以及植物体内H2O2和MDA含量及CAT活性的变化进行了测定.本研究发现,30μmol/L Cd2+浓度胁迫条件下,Col、fib8和fib1a的萌发未受到抑制,但根长生长都受到了抑制,fib8和fib1a的抑制程度比Col更为明显,表明突变体比野生型对镉胁迫更敏感.进一步测定镉胁迫前后Col、fib8和fib1a体内的H2O2和MDA含量及CAT活性的变化,结果显示Col、fib8和fib1a体内的H2O2含量增加量分别为处理前的1倍、10倍、8倍,Col、fib8和fib1a体内的MDA含量增加量分别为处理之前的2倍、14倍、12倍,Col、fib8和fib1a体内的CAT活性下降程度相似约为20%.由实验结果推测Fibrillins可能通过影响植物体内H2O2和MDA含量的变化参与植物响应重金属镉胁迫.     

拟南芥活性氧响应基因GDI功能初步分析

从拟南芥(Arabidopsis thaliana)T-DNA插入突变体库中筛选分离到活性氧敏感突变体gdi并克隆出相应基因GDI,生物信息学分析发现该基因具有多个ABA及氧化胁迫相关顺式作用元件,定量PCR及GUS染色结果表明该基因主要在花器官中表达,激光共聚焦实验显示GDI蛋白在细胞质中广泛分布.     

缺失AtArm基因导致拟南芥耐热性下降

生物信息学数据表明,At3g09350基因编码一种受高温诱导的armadillo,beta-catenin repeat蛋白,但其生物学功能迄今不详,我们利用基因组DNA PCR、RT-PCR和Western-blotting方法,对该T-DNA插入拟南芥突变体进行了筛选,获得At3g09350基因被敲除的T2代纯合突变体,通过表型分析,我们发现,该突变体的获得耐热性明显下降,呈现热敏感表型.分子进化分析结果表明,该基因为微牛物和动物Hsp70s的核苷酸交换因子的同源物,它的缺失可能导致Hsp70s分子伴侣活性下降,进而导致拟南芥耐热性下降.     

青大1号紫花苜蓿愈伤组织的诱导

为了探讨青大1号紫花苜蓿愈伤组织的最佳诱导条件,本文以MS培养基为基本培养基,分别选用青大1号紫花苜蓿的种子、无菌苗的叶片、根为外植体,通过改变MS培养基中生长素(2,4-D)和细胞分裂素(6-BA)的配比以及光照条件,研究影响紫花苜蓿愈伤组织形成的条件因素。结果表明:在25℃光照/黑暗(16 h/8 h)条件下,选用种子为外植体,在添加40μmol/L 2,4-D和15μmol/L 6-BA的MS培养基上愈伤组织诱导率为92.5%;选用叶片为外植体,在添加45μmol/L 2,4-D和10μmol/L 6-BA的MS培养基上愈伤组织的诱导率为45%;选用根为外植体,在添加10μmol/L2,4-D和2.5μmol/L6-BA的MS培养基上愈伤组织的诱导率为40%;全日照或者全黑暗都不利于紫花苜蓿愈伤组织的诱导。继代培养发现,25℃光照/黑暗(16 h/8 h)条件下,10μmol/L 2,4-D的MS培养基上最适宜紫花苜蓿的愈伤组织继代生长。青大1号紫花苜蓿愈伤组织形成的最佳组合为:选用种子为外植体,25℃光照/黑暗(16 h/8 h)条件下,添加40μmol/L 2,4-D和15μmol/L 6-BA的MS培养基进行诱导,10μmol/L 2,4-D的MS培养基进行继代生长。     

增施铁对镉胁迫下柳树生长及光合生理性能的改善

【目的】了解Cd胁迫及增施Fe对不同柳树生长及光合生理的影响,探讨增施Fe对降低柳树Cd毒害和提高Cd耐性以及对柳树Cd修复的Fe调控作用。【方法】以旱柳‘Levante’和蒿柳无性系79026及790260为材料,利用1/2 Hoagland营养液(含25 μmol/L EDTA-Na₂Fe)培养法,以不同Cd浓度(0、10、50、100 μmol/L)(不增施Fe)和上述Cd浓度下增施Fe(25 μmol/L)两组处理,培养42 d后测定不同柳树生长量(苗高和地径)、干物质量(根、茎、叶)、光合作用指标(叶绿素a、b含量、叶绿素a/b、净光合速率、气孔导度和胞间CO₂浓度)和Cd、Fe含量(根、茎、叶)。【结果】①随着Cd浓度增大,3个无性系/品种生长量、干物质量、叶绿素a、b含量、净光合速率、气孔导度和Fe含量(茎、叶)减少,叶绿素a/b、胞间CO₂浓度、Cd含量(根、茎、叶)增大,但根Fe含量在低中浓度Cd(10、50 μmol/L)时逐渐增大,在高浓度Cd(100 μmol/L)时减少。在相同Cd浓度胁迫下,3个无性系/品种Cd和Fe含量大小为根﹥叶﹥茎,旱柳根Cd含量大于蒿柳,但叶Cd含量小于蒿柳。②与低浓度Cd时增施Fe相比,在中高浓度Cd时增施Fe后,3个无性系/品种叶绿素a、b含量、旱柳‘Levante’和蒿柳79026生长量和干物质量(旱柳‘Levante’茎除外)、旱柳‘Levante’叶绿素a/b和叶片净光合速率均显著减小,而3个无性系/品种Cd含量增大,Fe含量减少。在高浓度Cd时增施Fe后旱柳‘Levante’和蒿柳790260叶Cd含量均小于中浓度Cd时增施Fe的,且旱柳Cd含量(根、茎、叶)和Fe含量(叶)均小于蒿柳。③增施Fe提高了Cd胁迫下柳树生长和干物质量、叶绿素a、b含量、气孔导度及胞间CO₂浓度,特别是在高浓度Cd时增施Fe后降低了3个无性系/品种根和叶Cd含量,增加了茎Cd含量,旱柳Cd含量(根、茎和叶)均小于蒿柳。【结论】Cd胁迫抑制了柳树生长和干物质积累以及叶绿素合成、光合作用,在中、高浓度Cd胁迫时,对旱柳生长和干物质量积累的抑制作用大于蒿柳; 柳树根的Cd和Fe积累能力大于茎和叶,蒿柳Cd积累能力大于旱柳。增施Fe提高了Cd胁迫下柳树生长量和干物质量以及叶绿素含量,不同程度地增加了Cd含量和Fe含量,一定程度上缓解了Cd胁迫对柳树光合作用的影响,且对旱柳的影响作用大于蒿柳,这证实了Cd胁迫下增施Fe改善Cd胁迫下柳树对生长和生理的适应性。     

抗蛋氨酸结构类似物突变株的筛选

以北京棒杆菌AS1.299经诱变后获得的高产蛋氨酸突变株N3-10作为出发菌株, 依次采用蛋氨酸结构类似物亮氨酸、 原亮氨酸和乙硫氨酸平板对
诱变后的突变株进行筛选, 得到蛋氨酸高产菌株依次为L3,LN7和E31. 结果表明, 亮氨酸对突变株N3-10的抑制质量浓度为8 g/L, 原亮氨酸对突变株L3的抑制质量浓度为3 g/L, 乙硫氨酸对LN7突变株的抑制质量浓度为3 g/L, 经紫外诱变和3种蛋氨酸结构类似物的筛选, 最终获得蛋氨酸产量最高突变株E31, 产量为1.479 g/L, 比出发菌株N3 10蛋氨酸产量高0.379 g/L. 经5次传代, 产量稳定.     

镉胁迫对两种豆科牧草种子萌发和幼苗生长的影响

利用水培法研究不同浓度的氯化镉(0.4μmol/L、0.8μmol/L、1.2μmol/L、1.6μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L、8.0μmol/L、10μmol/L)处理对白三叶和苜蓿种子发芽率、幼苗根长、茎长和鲜重、平均干重的影响.结果表明:白三叶和苜蓿种子的发芽率、平均根长、平均茎长、平均鲜重、平均干重,经不同浓度氯化镉溶液处理后都表现出低浓度的刺激效应和高浓度的抑制效应.当氯化镉浓度为2.0μmol/L时能促进白三叶生长,超过2.0μmol/L表现为抑制作用;当氯化镉浓度为1.2μmol/L时促进苜蓿生长,大于1.2μmol/L表现出抑制效应.     

铝浸种对小白菜种子萌发和幼苗生理特性的影响

以2个小白菜品种南京长梗和抗热605为试验材料,研究了不同浓度铝浸种后种子萌发和幼苗生理特性的变化.结果 表明,10～5000μmol/L的铝浸种处理对2个小白菜品种的发芽率无明显影响.5000 μmol/L的铝处理显著降低了小白菜的发芽势、发芽指数和活力指数.种子萌发后,南京长梗和抗热605分别在100和1000 μ...     

草地早熟禾ISSR-PCR反应体系优化

采用正交设计和单因子试验结合的方法,优化适合于草地早熟禾的ISSR体系。对影响ISSR-PCR的多个因素,包括MgCl2、dNTP、Primer、TaqE的浓度和用量进行优化,同时,对DNA模板浓度、引物退火温度进行筛选。确定草地早熟禾的最佳ISSR-PCR反应体系为：94℃预变性5min,94℃变性30 s,Tm值退火45 s,72℃延伸90 s,35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存;20μL反应体系包括2μL10×Buffer,0.96μL dNTP（2.5×10^-3mol.L^-1）,1μL Primer（1.0×10^-5mol.L^-1）,0.2μL Taq酶（5 U.μL^-1）,1μL Template DNA,14.84μL H2O。     

Effects of five heavy metals at sub-lethal concentrations on the growth and photosynthesis of Chlorella vulgaris

The impact of sub-lethal concentrations(0.05,0.5,5 μmol L 1) of the heavy metals copper(Cu),chromium(Cr),zinc(Zn),cadmium(Cd) and lead(Pb) on the growth and photosynthesis of Chlorella vulgaris was studied during 96 h exposure experiments.The results showed that the effects of these five metals on the growth of Chlorella vulgaris were dependent on both concentration and exposure time.It was found that 5 μmol L 1 treatments of Cu,Cr,Zn,Cd and Pb significantly inhibited the growth of Chlorella vulgaris,and the effect became weaker with an increase in exposure duration.Different effects on chlorophyll fluorescence were found for different metals,with Cu and Cr having an inhibiting effect and Zn and Cd having a promoting effect.The effects of heavy metals upon the growth and photosynthesis of Chlorella vulgaris were independent of each other and not causally related.     

棉花DELLA蛋白GhGAl4a基因在拟南芥中功能初步分析

为了探究棉花DELLA蛋白基因GhGAI4a在拟南芥中的功能,构建植物表达载体pBP35S：GhGAI4a和pBP35S：Ghgai4a,利用农杆菌介导的花滴法将其转入Col野生型拟南芥。结果显示,2个载体各自获得6个独立的转基因拟南芥纯合株系。分别统计48—96h种子萌发率,测量生长7d后幼苗的主根长度,与非转基因植株相比,过量表达GhGAI4a、Ghgai4a对拟南芥种子萌发及主根生长具有明显的抑制作用。1μmol／LGA处理转基因植株,GhGAI4a转基因植株主根长和萌发率均增大,而Ghgai4a转基因植株主根长度和萌发率均无显著变化。     

高浓度CO2对红松幼苗及土壤碳氮特征的影响

为探知红松苗对未来大气CO₂浓度的碳、氮响应策略,系统了解不同CO₂浓度下红松幼苗及其土壤碳、氮特征,采用生长箱培养法,分别研究了350、700 μmol/mol CO₂浓度下红松幼苗主要器官碳、氮浓度与积累(吸收)量变化,并分析其培养土壤的碳、氮含量。结果表明:与低浓度CO₂处理相比,高浓度CO₂处理并未对红松幼苗根、茎及叶的碳浓度产生显著影响,但导致叶碳积累量显著增加37.63%; 高浓度CO₂培养导致红松幼苗根、茎、叶氮浓度显著降低,茎氮吸收量显著下降27.45%,根、茎、叶的碳氮比升高,土壤溶解性有机碳含量显著增加28.82%,总有机碳、微生物量碳、全氮、微生物量氮及水解性氮含量均未发生显著变化,碳氮比增加。总体上,3年生的红松幼苗氮浓度、碳氮比、叶碳积累量及土壤溶解性有机碳对CO₂升高响应迅速。     

观赏海棠SSR-PCR体系优化及引物筛选应用

【目的】为探究适用于观赏海棠SSR反应分子标记研究的最佳PCR反应条件,采用正交设计法对观赏海棠SSR-PCR体系进行优化,并利用优化体系筛选适于观赏海棠的多态性SSR引物。【方法】以6个二倍体观赏海棠DNA模板为材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验对DNA模板浓度、Taq酶浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度和dNTP浓度进行优化实验,确立了观赏海棠SSR-PCR最佳反应体系。【结果】得出15 μL优化体系各成分为:DNA模板5 mg/L、Taq酶1.25 U、引物0.3 μmol/L、Mg²⁺ 2 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、1×Buffer1.5 μL。利用优化体系在73对苹果属SSR引物中筛选出15对条带清晰、多态性丰富、重复性好的SSR 引物并确定各引物的退火温度,其多态信息含量均大于0.25。【结论】正交试验结果达到优化目的,利用优化体系筛选的15对多态性引物可直接应用于观赏海棠SSR分子标记实验中,为观赏海棠品种鉴定、分类以及遗传育种等研究提供了有效工具。     

甜荞愈伤组织分化研究

研究了龙山荞、浦江荞、美国荞和牡丹荞四种甜荞子叶和下胚轴的愈伤组织形成与分化的影响因子.结果表明：17.8μmol/L～26.6μmol/L（4.0 mg/L～6.0 mg/L）的BA与0.9μmol/L（0.2 mg/L）的2,4-D配合使用可有效促进甜荞愈伤组织中芽的分化和芽的生长;高浓度的蔗糖（4.5%～6.0%）促进甜荞愈伤组织根的分化和愈伤组织的生长;在培养基中附加活性炭抑制甜荞愈伤组织分化根.