猪瘟病毒基因组非编码区的定性、定量与结构分析

猪瘟病毒是猪瘟的病原体，弄清其基因组的复制与表达是研究猪瘟致病机理、研制抗病毒药物的核心，基因组的非编码区（UTR）是复制和表达的主要调节区，为了确定复制与表达位点在非编码区的具体位置以及主要特征，对猪瘟病毒石门株以及其他毒株基因组的3′和5′非编码区进行了生物信息学的定性、定量与结构分析，分别得到17个毒株的3′UTR和56个毒株的5′UTR与调节复制、表达起始有关的位点以及共有的保守序列和结构成分，这些顺式调控元件可能是复制起始识别位点、宿主细胞转录因子的结合位点和核糖体起始蛋白质合成的作用位点，据此，对猪瘟病毒复制与表达的机理进行了探讨，为进一步实验提供了非常明确的方向，同时也为与猪瘟病毒同科的丙型肝炎病毒、其他瘟病毒以及其他正链RNA病毒基因组复制的研究奠定了基础。     

1970~2004年全球肠道病毒71型分离株的分子流行病学分析

人类肠道病毒71型（EV71）是引起手足口病的主要病原体，常导致严重的神经综合症。近年来病毒多爆发于亚太地区的热带区域。为了研究人类肠道病毒的进化历程以及遗传变异性，我们搜集了全球在1970年至2004年间分离的532株病毒的序列信息，这些信息包含了完整或接近完整的VP1片段序列(全为891个氨基酸)。经过两两序列比对以及遗传距离的分析，发现绝大多数病毒株属于先前分类的B或C型。同时，也观察到一种特殊的不属于任何分型的毒株R13223-IND-01，可能代表了一种新的病毒分型。在B型和C型病毒中，存在着一些区别于同型其他亚型的“孤儿株”，它们的出现在病毒进化分析中有重要的意义。此外，VP1片段上有6个位于离散位置的氨基酸存在共变异的现象，分析发现这种高比例的共变异与病毒亚型有着紧密的联系。     

脊髓灰质炎病毒琼脂弥散沉淀反应的研究

琼脂弥散沉淀试验曾用于流行性感昌病毒、痘类病毒、脊髓灰质炎病毒(以下简称灰质炎病毒)、腺病毒和某些肠道病毒的研究。本文报告我们对灰质炎病毒的沉淀抗原的制备、试验的技术方法及強毒株和減毒株的抗原性进行研究的结果。材料和方法一、病毒株所用病毒株包括Ⅰ型(Mahoney)、Ⅱ型(MEF_2)和Ⅲ型(Saukett)灰质炎病毒原型株及Ⅰ型(L.Sc.2ab)、Ⅱ型     

牛Ⅰ型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性

通过同源重组将pHA2质粒插入到牛Ⅰ型疱疹病毒ZJ分离株基因组的UL15和UL18基因之间, 构建了重组病毒rBHV1-HA; 提取重组病毒的环状基因组DNA, 转化大肠杆菌DH10B, 获得了含有BHV1全基因组的感染性细菌人工染色体克隆pBHV1. pBHV1转染MDBK细胞可以拯救出病毒, 该病毒与野生毒株在细胞上的繁殖特性未见差异. 通过两步Red E/T重组, 构建了gN基因跨膜区缺失的pBHV1突变体, 并转染获得了重组病毒rBHV1-?gN. 病毒繁殖动态曲线显示, rBHV1-?gN的滴度比野生毒株低9%~20%. BHV1感染性克隆的成功构建, 将为研究新型BHV-1基因缺失疫苗和牛的病毒载体疫苗提供技术平台.     

深圳口岸输入寨卡病毒的基因和生物学特性分析

2016年2月14日下午,一名从斐济和萨摩亚旅游回国的旅客在深圳皇岗口岸入关时有发热症状,其在旅行期间有蚊虫叮咬史.经过病因筛查和诊断确诊为寨卡病毒感染.本研究利用乳鼠和细胞培养传代,成功从病人血清中分离到致病病原——寨卡病毒,命名为SZ_SMGC-1.分离病毒在电子显微镜下可见圆球形经典黄病毒特征,病毒颗粒直径大小约为50 nm.利用特异性引物扩增并获得了病毒全基因组序列,同源性分析显示:SZ_SMGC-1与我国输入性病例中斐济/萨摩亚来源病毒高度同源,同源性均为99.9%,与委内瑞拉来源病毒同源性在99.0%~99.4%之间.研究显示,寨卡病毒进化为亚洲和非洲2个分支.进一步遗传进化分析表明,SZ_SMGC-1毒株与近期我国分离毒株同属于亚洲分支;SZ_SMGC-1与斐济/萨摩亚来源病毒聚类在一个亚分支;委内瑞拉来源的病毒除我国首个病例处于单独的小分支外,其余病毒全部聚类到另一个小分支.生物学特性研究显示,SZ_SMGC-1寨卡病毒可以在蚊虫来源C6/36细胞和哺乳动物来源Vero,BHK-21细胞中生长,感染Vero和BHK-21细胞后可见明显病变并形成典型噬斑.值得注意的是,相同细胞系的不同细胞克隆株对寨卡病毒的敏感性不同.寨卡病毒感染敏感哺乳动物细胞系的建立,对病毒致病机制的深入研究及相关疫苗和药物的研发奠定了基础.寨卡病毒在我国的输入,给我国寨卡疫情防控带来了严峻挑战,必须提早采取灭蚊等防控措施,加紧对疫苗和相关药物的研发,做好预防寨卡流行的技术储备.     

传染性喉气管炎病毒糖蛋白G基因的原核表达、细胞定位及功能研究

克隆测定了传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京E3和Zhonghai毒株的糖蛋白G基因(gG)序列, 并与多种动物的Ⅰ型α-疱疹病毒gG基因序列作了比对. 通过克隆gG基因至原核表达载体pET30a(+)构建pET30a-gG质粒, IPTG诱导表达含pET30a-gG重组质粒的阳性宿主菌后, 分离纯化得到分子量约35 kD的His-GG融合蛋白. 利用该融合蛋白制备的纯化的抗His-GG大鼠多抗血清, 观测ILTV糖蛋白G的在细胞上的分布, 发现糖蛋白G主要存在于宿主细胞的细胞核外周及细胞膜上, 在散在细胞内的分布较为分散, 而在融合细胞的结合部位分布较为集中. 利用抗体中和病毒糖蛋白G的实验结果表明, 糖蛋白G可能参与病毒从细胞到细胞的直接感染(CTCS), 从而影响病毒复制和噬斑的形成.     

Vero细胞培养传代后的2株SARS冠状病毒基因组序列变异分析

RNA病毒在复制时有易出错的倾向, 因此SARS病毒在传染或传代过程中易发生突变而产生不同的毒株, 这种机制也利于病毒逃脱宿主的免疫系统而生存下来. 许多研究也表明, 不同的SARS病毒分离株的全基因组序列存在不同程度的差异, 这些差异的研究无疑对SARS病毒疫苗的研制具有重要的指导意义. 同时, 对SARS病毒在传代过程中的遗传稳定性及核酸特性的分析, 是SARS疫苗研制不可或缺的环节. 采用PCR产物直接测序的方法, 对2株用Vero细胞培养经过多次传代的SARS病毒进行了全基因组序列的测定, 通过比较分析发现该病毒在传代过程中具有高遗传稳定性, 其中检定参比株(Sino1株)2和11代全基因组序列比较有4个碱基的变化, 而候选疫苗株(Sino3株)3与10代的基因组全序列仅有1个碱基的差异. SARS病毒在Vero细胞上传代的遗传稳定性表明, 以此制备的灭活病毒疫苗是稳定的.     

单纯疱疹病毒核壳体在细胞质中装配方式的进一步研究

一般认为,疱疹病毒的核壳体在感染细胞核内装配。在研究单纯疱疹病毒(HSV)的形态发生时,我们观察到HSV核壳体在胞质内进行装配的现象。为了对这一发育方式进行深入研究,我们联合应用超薄切片和免疫铁蛋白电镜技术,对HSV Ⅰ型、Ⅱ型感染的不同细胞作了电镜观察,得到一些新的形态学证据,进一步证实HSV胞质内形态发生方式的存在。     

口蹄疫病毒OH/CHA/99株全长基因组感染性克隆的构建

以构建的口蹄疫病毒OH/CHA/99株全长cDNA为模板, 使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录, 得到病毒RNA. 用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞, 可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应. 对收获的病毒分别用RT-PCR, 乳鼠毒力试验以及免疫电子显微镜观察等方法进行鉴定, 结果表明拯救到特定的口蹄疫病毒. 同时用空斑实验法观察了拯救病毒及其亲本毒株的生长特性, 结果表明二者在致病性上没有明显差异, 这将为进一步探索猪口蹄疫病毒致病的分子机制及研制新型口蹄疫疫苗奠定良好的基础.     

AcMNPV诱导sf9细胞在核内产生纤维网状基质

来源于昆虫卵巢的sf9体外传代细胞 ,在核内虽存在核纤层却没有哺乳动物细胞核内那样的核基质网络 .当其被NPV感染后核内产生纤维网络结构 .快速冷冻 深度蚀刻电镜图象显示这种网络由 8～ 10nm的均一纤维交织而成 .有一些电子致密的物质与未装配好的病毒衣壳存在于网络结构中或周围 ,说明核内产生的纤维网络结构可能与NPV的复制与装配有关     

艾滋病疫苗的科学挑战和应对策略

在经历30年两代疫苗的失败后,一、二代联合人免疫缺陷病毒(HIV)疫苗(痘病毒ALVAC和gp120)终于在泰国RV144试验中显示了31%保护效果,尚无法用于预防工作.HIV疫苗的科学挑战为,病毒在自然感染中难以产生有效的免疫保护,只有另辟蹊径才能攻克这一进化的瓶颈.近年HIV疫苗不乏新的研究进展,从HIV感染精英控制者发现了超强广谱中和抗体,设计了一批稳定膜蛋白三聚体结构的新免疫原,探索了一些激活广谱中和抗体胚系B细胞的新方法,使用复制型病毒载体增强疫苗的免疫原性和持久性等.HIV临床试验也明显得到加快,与前30年仅开展了4个Ⅱb/Ⅲ期试验不同,未来5年将开展一批Ⅱb/Ⅲ期临床试验,包括南非重复RV144疫苗的试验已于2016年开始,强森公司与哈佛大学研制的Ad26/gp140疫苗的试验计划于2017~2018年启动,中国疾病预防控制中心和美国国立卫生研究院(NIH)联合开展前者的DNA复制型痘病毒(rTV)和后者的gp145疫苗的联合临床试验(比较复制型(rTV)与非复制型(ALVAC)痘苗疫苗的保护性),NIH的两个CHAVI-ID项目和疫苗研究中心正全力推进新型膜蛋白疫苗大规模临床试验等.这些HIV疫苗的研究有望对2030年终结艾滋病的事业做出应有的贡献.     

中和性单克隆抗体对Ⅰ型脊髓灰质炎病毒的抗原分析

脊髓灰质炎病毒型内毒株间存在着一定抗原差异。过去沿用的一些脊髓灰质炎病毒型内毒株特征鉴别试验只能大致把每个型的脊髓灰质炎病毒区别为三类,即类Sabin株(SL),中间株(Ⅰ)和非类Sabin株(NSL)。这种粗略的分类有很大的局限性。所以病毒学家一直试图得到单特异性的抗血清来进行更精细的抗原分析。单克隆抗体的产生使这一愿望的实现成为可能。如能应用单克隆抗体对脊髓灰质炎病毒进行分析,进一步识别毒株间细微而重要的抗原差异,建立新的亚型划分,对脊髓灰质炎的流行病学和疫苗安全性评价,都具有重要意义。     

meq与lorf9双基因缺失显著降低超强马立克氏病病毒的复制能力

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)感染引起以鸡体严重免疫抑制和内脏肿瘤为主要特征的马立克氏病(Marek’s disease, MD). MDV的感染过程分为早期溶细胞感染、潜伏感染、肿瘤转化和再次激活感染4个阶段.为了研究构建的meq与lorf9双基因缺失重组毒株在宿主体内的复制特性,应用实时荧光定量PCR技术(Realtime PCR)对MDV感染后第6, 14日龄鸡脾脏中的病毒拷贝数进行检测,结果表明,双基因缺失病毒在早期溶细胞感染和潜伏感染期中的复制显著降低;对MDV感染后第63日龄鸡的脾脏和羽毛囊中的病毒拷贝数进行定量分析,结果表明meq与lorf9双基因缺失也显著降低了病毒在肿瘤转化期和再次激活阶段的感染拷贝数.本研究为进一步探讨meq与lorf9双基因缺失在MDV致病和免疫机制中的作用提供了理论基础.     

深海病毒的特征及其生态学功能探讨

病毒是自然环境中丰度最高的生物类群,对海洋生态系统中的物质能量循环和种群平衡调节发挥着不可或缺的作用.深海是海洋生态系统的重要组成部分,深海微生物面临多重极端环境压力.近年来,深海病毒相关的研究揭示了其在深海环境中的高丰度和多样性,以及其重要的生态学功能.本文从深海病毒的主要特征、与环境因子的相关性、深海病毒的分离与鉴定及其生理及生态功能这4个方面进行了概述,并对未来研究的潜在方向做了展望.     

RDD基序对口蹄疫Asia1型毒株感染力的影响

不同型口蹄疫病毒1D蛋白的βG和βH链之间都含有一个高度保守的RGD基序,其结合细胞受体,起始病毒感染.但本文通过对Asia1型FMDV的1D序列分析证实,田间毒株含有RGD和RDD基序(RGD中的G突变为D)的两种类型毒株.通过反向遗传技术制备了分别含有RGD和RDD基序的两种病毒,测定其生物学特性,并通过细胞感染力和乳鼠致病力比较这两种病毒感染力的差别.结果表明,含有RGD和RDD的毒株都具有感染性,含有RDD毒株的细胞感染力和乳鼠致病力比含RGD的高10倍左右,为进一步阐明RDD基序Asia1毒株的感染机制的分子基础奠定必要的基础.     

RNA干扰介导对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区或表面抗原编码区的siRNA表达载体pSI-C和pSI-S, 在体外HBV复制细胞模型中观察对HBV复制和表达的影响. 将pSI-C, pSI-S与1.3倍HBV真核表达质粒pHBV共转染HepG2细胞, 分别在转染后24, 48和72 h, 观察pSI-C和pSI-S对细胞上清和胞内病毒抗原表达的影响, 并用分子杂交方法从病毒复制、转录和翻译水平检测目的基因的表达情况. 实验结果表明, pSI-C及pSI-S能明显抑制细胞内HBsAg和HBcAg的合成, 呈序列特异性和剂量依赖性的特点, 而对照组siRNA无抑制作用. pSI-C比pSI-S抑制作用更强, 转染后第2天对HBsAg和HBeAg抑制率达高峰, 分别为92%和85%. Southern和Northern杂交结果表明, HBV siRNA能降低目的基因转录和病毒复制中间体的表达水平, 提示针对乙型肝炎病毒核心区和表面抗原编码区的siRNA能有效抑制HBV RNA分子转录和病毒复制, 最终降低病毒抗原表达, 这为运用RNAi技术进行HBV基因治疗提供了新的思路.     

1994年北京急性出血性结膜炎病毒的分离与鉴定

急性出血性结膜炎(AHC)可象流感样反复流行或大流行,自1971年传入我国以来曾多次在许多地区发生流行。1988年的流行人们还记忆犹新,1994年又再次发生流行。引起AHC病毒主要为肠道病毒70型(EV70)和柯萨奇病毒A24型变异株(CA24V)。在每次流行时进行病原学研究和对分离毒株作抗原分析,对于探讨本病反复流行的原因及疫情的预测、预报有重要意义。     

带有REV-LTR片段的MDV野毒株GX0101 BAC克隆的构建及拯救病毒的致病性分析

将整合有禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis, REV)长末端重复序列(LTR)的马立克氏病病毒(命名为GX0101)全基因组作为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆进大肠杆菌. BAC载体通过同源重组插入MDV基因组的US2区, 含BAC载体的MDV DNA电转化大肠杆菌菌株DH10B, 鉴定含MDV全基因组的BAC克隆(MDV BAC), 提取BAC DNA, 转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF), 成功拯救出了重组病毒, 命名为bac-GX0101. 将此病毒腹腔接种1日龄鸡, 在攻毒后62 d开始检测到内脏肿瘤, 动物实验结果表明, bac-GX0101毒株与亲本GX0101毒株对机体的致病性等方面的影响没有差异, bac-GX0101毒株仍然保留着很好的免疫抑制功能及致肿瘤能力. 该感染性克隆bac-GX0101为研究该重组野毒株中REV-LTR插入片段及其他基因的生物学功能提供了有用的技术平台.     

HBx对HBV复制的调控

乙型肝炎病毒(HBV)是导致肝细胞肝癌(HCC)发生发展的重要诱因之一. HBV在感染细胞后进行病毒DNA的复制、病毒蛋白的合成以及新病毒颗粒的包装和释放等步骤,其中病毒感染细胞逃避宿主免疫后,就可能通过HBV复制产生子代病毒、形成持续感染、诱导肝癌的发生发展.机体中HBV的复制受到多种因素的影响,而乙型肝炎病毒的X蛋白(HBx)对于HBV复制的影响是其中一个重要因素.本文在对HBx蛋白的结构组成及其分布做简要阐述的基础上,重点综述HBx通过不同的修饰途径来调控HBV的复制,以及HBx通过mi RNA来调节HBV复制的进程.     

中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ A-Rich区的功能鉴定

DNAβ是近年来在一些单组分双生病毒中发现的一类新型卫星DNA分子, DNAβ对于这些病毒诱导典型的病害症状是必需的. DNAβ上含有3个相对保守的区域: 共同区、βC1基因和A-Rich区(A含量 > 60%). 在对中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10)DNAβ βC1基因的功能突变研究的基础上, 对TYLCCNV-Y10 DNAβ上的A-Rich区进行了功能鉴定. 对TYLCCNV-Y10 DNAβ A-Rich区进行缺失突变后发现, A-Rich缺失突变体依然能够在植物中稳定复制和系统移动, 因此A-Rich区对于DNAβ的复制并不是必需的. 免疫捕获PCR检测发现, A-Rich缺失突变体能够包裹在TYLCCNV-Y10 DNA-A编码的外壳蛋白之中, 表明它并不能决定DNAβ的包裹, 但是A-Rich区的缺失使病毒症状减弱.