人卵巢癌细胞靶向多肽的筛选与初步鉴定

采用改良的生物淘筛(Biopanning)流程,以人卵巢癌细胞为靶细胞进行5轮消减筛选,从噬菌体展示12肽文库(Ph.D-12phage displayed peptide library)筛选到靶向人卵巢癌的12肽克隆,通过ELISA、细胞免疫荧光法等方法从细胞水平鉴定了最佳阳性多肽噬菌体克隆R20靶向卵巢癌细胞的特异性和敏感性。结果显示:R20可以特异的、敏感的与卵巢癌细胞SKOV3结合,不与正常细胞或者其他癌细胞结合,具备进一步研发为卵巢癌导向分子元件而应用于卵巢癌靶向诊治试剂或药物研发的潜力。     

MiR-17促进胃癌细胞上皮间质转化机制

目的 探讨miR-17调控胃癌细胞上皮间质转化的作用机制.方法 检测胃癌组织和胃癌细胞系中miR-17的表达水平;分别将miR-17模拟物(抑制物)和TGFBR2过表达载体(siRNA)转染到SGC-7901胃癌细胞中,通过MTT法、流式细胞术、Transwell实验和Western blotting检测细胞增殖、凋亡、侵袭和EMT标志蛋白表达;荧光素酶报告基因分析验证miR-17与TGFBR2的靶向关系.结果 胃癌组织和胃癌细胞系中miR-17表达上调;过表达miR-17促进SGC-7901细胞增殖、侵袭,抑制凋亡;miR-17靶向TGFBR2的3'UTR;过表达TGFBR2抑制SGC-7901细胞增殖、侵袭,促进凋亡;miR-17通过激活PTEN/PI3K/AKT信号通路促进SGC-7901细胞EMT.结论 miR-17靶向下调TGFBR2表达,激活PTEN/PDK/AKT信号通路,促进SGC-7901细胞EMT.体内研究结果证明miR-17促进肿瘤的生长.因此,miR-17可能是胃癌抗转移治疗的潜在策略.     

HPV 58型E7蛋白特异结合多肽的筛选及分析

 利用M13噬菌体展示技术筛选HPV 58型E7蛋白特异性结合12肽,对这些多肽的序列比对分析得出其共有序列,同时通过BLASTP序列对比分析获得能与E7结合的内源蛋白.利用GST-E7融合表达蛋白为正筛靶分子,GST蛋白为负筛靶分子进行4轮的正负亲和筛选,经过ELISA活性鉴定获得71株阳性克隆,通过DNA测序和序列分析,得到2个能与E7蛋白发生特异性结合的共有序列NHXXANPQQXPQ和TMGFTAPRF-PHY.通过BLASTP分析所有71个多肽在体内的同源蛋白,它们能为对E7蛋白的致癌机理研究提供方向.     

小鼠胚胎干细胞R1表面特异结合多肽的筛选

胚胎干细胞是从哺乳动物胚胎发育早期的囊胚的内细胞团内分离出来的一类细胞,具有自我更新和全能性的基本特征.作者利用M13噬菌体展示技术筛选与未分化的小鼠胚胎干细胞R1表面特异结合的多肽.实验利用未分化的小鼠胚胎干细胞为筛选靶细胞,分化的小鼠胚胎干细胞为吸附细胞,进行3轮的消减筛选,经细胞ELISA鉴定,噬菌体DNA测序和多肽序列分析,得到13条能与小鼠胚胎干细胞特异结合的多肽.通过BLASTP比对发现有11个体内的同源蛋白,为进一步研究小鼠胚胎干细胞表面分子提供研究基础.     

中药防风对胃癌SGC-7901细胞生长及基因表达的研究

目的 研究中药防风对胃癌SGC-7901细胞生长及基因表达的影响.方法 应用集落形成实验、MTT实验及电子显微镜技术观察了防风对SGC-7901细胞生长的影响;应用免疫组织化学染色技术研究防风对SGC-7901细胞基因表达的影响.结果 防风对SGC-7901细胞的生长曲线、集落形成有明显的抑制作用,其抑制作用与防风的浓度和时间呈正相关关系,其IC50值为24g/mL.防风能使SGC-7901细胞p16和p21编码基因的蛋白表达上调,PCNA,C-Met编码基因的蛋白表达下调.结论 防风能抑制SGC-7901细胞生长;防风可使SGC-7901细胞的p16,p21,PCNA,C-Met表达改变.这些结果 为防风在临床上的进一步应用提供了理论依据.     

白屈菜碱对SGC-7901细胞Cdk1、cyclinB1表达影响

研究白屈菜碱对人胃癌SGC-7901细胞Cdk1、p-Cdk1(Thr14)、cyclinB1蛋白表达,探讨白屈菜碱诱导人胃癌SGC-7901细胞G2/M期阻滞的机制.采用Western blotting法测定白屈菜碱对SGC-7901细胞Cdk1、p-Cdk1(Thr14)、cyclinB1蛋白表达的影响.不同质量浓度的白屈菜碱可显著下调人胃癌SGC-7901细胞内Cdk1与cyclinB1蛋白表达水平,同时显著上调p-Cdk1(Thr14)蛋白的表达水平,并呈一定的剂量依赖性.白屈菜碱可下调SGC-7901细胞内Cdk1和cyclinB1蛋白的表达,上调p-Cdk1(Thr14)蛋白的表达,这可能是白屈菜碱诱导SGC-7901细胞G2/M期阻滞的主要机制之一.     

野西瓜总皂苷诱导SGC-7901凋亡的初步研究

探讨野西瓜总皂苷诱导人胃癌SGC-7901细胞的凋亡作用.采用MTT法检测野西瓜总皂苷对SGC-7901细胞增殖的抑制作用;采用荧光倒置显微镜观察细胞凋亡的形态学变化;采用流式细胞术分析野西瓜总皂苷对SGC-7901细胞凋亡率的影响;采用激光共聚焦显微镜观测细胞内[Ca2+]i的变化.5、25、50、100、200和400 μg/mL的野西瓜总皂苷作用于SGC-7901细胞72 h后,野西瓜总皂苷可抑制SGC-7901细胞的增殖,其IC50为31.542 μg/mL;野西瓜总皂苷作用SGC-7901细胞40 h后,细胞出现早期凋亡细胞的形态;15、30、60 μg/mL的野西瓜总皂苷作用于SGC-7901细胞72 h后,细胞凋亡率分别为58.6%、92.298%、95.898%;15、30、60 μg/mL野西瓜总皂苷作用SGC-7901细胞24 h后,细胞内[Ca2+]i升高,并随野西瓜总皂苷给药剂量的增加而升高.野西瓜总皂苷能够促进SGC-7901细胞的凋亡,其作用机制可能与野西瓜总皂苷升高细胞内[Ca2+]i有关.     

野西瓜挥发油对人胃癌SGC-7901细胞的抑制

探讨野西瓜挥发油对人胃癌SGC-7901细胞生长的作用.采用MTT、SRB和肿瘤细胞集落形成能力实验观察野西瓜挥发油对SGC-7901细胞增殖的抑制作用;激光共聚焦显微镜观察FITC-Annexin V和PI双染法检测野西瓜挥发油作用于SGC-7901细胞后细胞凋亡的形态特征.结果显示,野西瓜挥发油可抑制SGC-7901细胞的生长,MTT与SRB法测得其IC50为145.5μg/mL,GI50为121.32μg/mL,LC50为900.96μg/mL,TGI为240.55μg/mL;野西瓜挥发油对SGC-7901细胞集落形成的IC50为160.04μg/mL.Annexin V/PI双染激光共聚焦显微镜观察到75、150、300μg/mL的野西瓜挥发油可诱导SGC-7901细胞出现凋亡早、中、晚期的细胞形态.提示野西瓜挥发油具有明显的抗肿瘤作用,其抑瘤机制可能为诱导肿瘤细胞凋亡.     

构建重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1及在胃癌细胞SGC-7901中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-N1-ND CyclinB1,并观察其在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及对SGC-7901活性的影响.方法:通过RT-PCR法扩增不可降解CyclinB1(ND CyclinB1),将其插入到pEGFP-N1载体的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-N1-ND CyclinB1,并以PCR、双酶切、测序鉴定.通过脂质体法转染胃癌细胞SGC-7901,进行荧光检测、Western blotting分析和流式细胞仪分析.结果:PCR、酶切及测序证明重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1构建成功.转染胃癌细胞SGC-7901 24 h后,荧光显微镜下观察到绿色荧光.Western blotting检测到CyclinB1的表达明显增加.流式细胞仪检测重组质粒细胞组凋亡指数高于对照组,差异有显著性.结论:成功构建pEGFP-N1-ND CyclinB1荧光真核表达载体,并可在SGC-7901细胞中有效表达.     

噬菌体展示技术筛选布鲁氏菌OMP25特异性结合肽

利用噬菌体展示技术和ELISA筛选与布鲁氏菌外膜蛋白OMP25结合的七肽分子.将纯化的OMP25-32a包被于聚乙烯板上,对随机噬菌体七肽库进行4轮筛选后挑取噬菌体克隆,ELISA鉴定噬菌体克隆对OMP25-32a的亲和力和特异性.并将阳性噬菌体克隆扩增、测序、获得多肽氨基酸序列,生物信息分析筛选出特异的环形七肽分子.结果从噬菌体七肽库中筛选出42个噬菌体阳性克隆,测序翻译得到对应的42个环形七肽分子;ELISA结果表明,42个噬菌体中9#、11#、35#、38#和41#与融合蛋白OMP25-32a具有较强的亲和性;生物信息学分析42个环形七肽分子中11#环形七肽与锌指蛋白ZNF446有高度同源性.筛选获得了与布鲁氏菌外膜蛋白OMP25相互作用的环形七肽分子LT-7C,为进一步研究抗布鲁氏菌病的药物治疗提供科学依据.     

ELISA法检测九香虫血淋巴诱导两种肿瘤细胞凋亡规律

为了检测九香虫血淋巴能否诱导肿瘤细胞发生凋亡,将20,30,40,50mg/L的九香虫血淋巴分别作用于体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞、人胃癌SGC-7901细胞,采用ELISA法检测其细胞组蛋白-DNA片断吸光度的变化规律.结果显示:1)SGC-7901与MCF-7的细胞组蛋白-DNA片断吸光度随九香虫血淋巴浓度的提高而增加;2)同浓度的血淋巴处理后的细胞组蛋白-DNA片断吸光度MCF-7大于SGC-7901,表明九香虫血淋巴对SGC-7901和MCF-7均可能诱导其细胞凋亡,且呈一定的浓度依赖性;此外还说明MCF-7较SGC-7901对九香虫血淋巴更敏感.     

多肽的表面展示与结构库

表面展示是一种新的基因操作技术,它使表达的多肽以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞表面,保持相对独立的空间结构和生物活性。该技术可用于研究多肽(蛋白质)的性质、相互识别和作用,并据此从巨大展示库中选择特定靶功能的多肽结构。常用丝状噬菌体、T₄噬菌体、λ噬菌体以及细胞构建表面展示系统。表面展示库包括重组噬菌体抗体库、随机短肽库、多肽构象库、cDNA展示库和基因突变体展示库。表面展示技术可用于人工抗体和疫苗的制备、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离、细胞表面工程的研究、多肽药物的研制,以及生物分子实验定向进化等研究。     

奥沙利铂黄芩素联合应用对胃癌细胞抑制作用的影响研究

目的观察奥沙利铂与黄芩素联用对人胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用.方法实验分为对照组、给药组(奥沙利铂组、黄芩素组、联合作用组).应用MTT法测定给药组不同给药浓度对胃癌SGC-7901细胞株增殖的影响;倒置显微镜下观察对照组、给药组培养48 h后的细胞形态学变化;应用流式细胞术检测对照组、给药组胃癌SGC-7901细胞株凋亡率;HOE33258染色观察细胞凋亡形态学改变.结果奥沙利铂组、黄芩素组、联合作用组均可有效抑制SGC-7901细胞增殖,呈明显的量效关系;其中联合作用组抑制率明显高于奥沙利铂组和黄芩素组,差异具有显著统计学意义(P0.01).奥沙利铂组、黄芩素组SGC-7901细胞凋亡率明显高于对照组,差异具有显著统计学意义(P0.05).联合作用组细胞凋亡率明显高于对照组、奥沙利铂组、黄芩素组,差异具有显著统计学意义(P0.05).结论奥沙利铂与黄芩素联用可显著抑制人胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖,诱导细胞凋亡.     

吴茱萸碱诱导人胃癌细胞SGC-7901细胞凋亡

探讨吴茱萸碱对人胃癌SGC-7901细胞的生长抑制、诱导细胞凋亡的影响.采用MTT法测存活率;光镜观察细胞形态学改变;流式细胞术测细胞凋亡;流式细胞仪检测线粒体膜电位.结果显示,吴茱萸碱能抑制胃癌细胞SGC-7901的生长.MTT法测得吴茱萸碱的IC50为3.15μg/mL.在光镜下观察药物作用24 h的细胞生长密度逐渐变疏,细胞变小,表面起皱,高质量浓度组大部分细胞破碎.流式细胞仪检测,用20、10、5、2.5、1.25μg/mL质量浓度的吴茱萸碱作用48 h均出现亚二倍体凋亡峰,凋亡率分别为27.273%、24.206%、20.575%、19.520%、18.361%.流式细胞仪测线粒体膜电位,用质量浓度2.5、1.25、0.625、0.313、0.152μg/mL的吴茱萸碱作用48 h后线粒体膜电位显著提高.提示吴茱萸碱通过诱导胃癌细胞SGC-7901的凋亡,而达到抗肿瘤作用.     

近红外荧光染料对胃癌细胞的特异性识别*

测试近红外荧光(near infrared fluorescence,NIRF)染料IR-783对胃癌细胞的特异性识别。将转染荧光素酶luciferase的人胃癌传代细胞SGC-7901皮下移植于裸鼠,7 d后分别使用NIRF染料IR-783和荧光素酶底物进行活体荧光成像和生物发光,测定肿瘤部位ROI(region of interest)值,连续检测并绘制NIRF强度与生物发光强度相关性曲线;选择前期建立的胃癌PDX(patient-derived tumor xenografs,PDX)模型免疫组织化学检测肿瘤组织中CEA与CK8/18的表达,确定移植瘤与原发肿瘤病理学一致性;将SGC-7901细胞和来自PDX模型的胃癌细胞分别培养24 h,分别加入线粒体示踪剂(mito-tracker)或溶酶体示踪剂(lyso-tracker),30 min后加入IR-783染料,在荧光显微镜下观察近IR-783染料在胃癌细胞中的结合部位;将正常胃上皮细胞分别与转染GFP的SGC-7901细胞和来自PDX模型的胃癌细胞共培养24 h后,加入IR-783染料,在荧光显微镜下观察近IR-783染料对胃癌细胞的特异性识别。活体成像结果显示,IR-783染料能够特异性的聚集于人胃癌裸鼠移植瘤部位;NIRF强度与luciferase强度的相关性达99%以上;PDX肿瘤与原发肿瘤中CEA与CK8/18表达均呈强阳性;荧光显微镜下检测到NIRF染料不仅能够特异性识别传代胃癌细胞,同时也能识别来自PDX模型的肿瘤细胞,并优先集聚在肿瘤细胞的线粒体与溶酶体中。近红外荧光染料IR-783能够特异性识别胃癌细胞,可用于胃癌模型的成像研究,是肿瘤治疗的一种潜在工具。     

燕麦多肽数据库及降血糖活性的虚拟筛选

为了深入研究燕麦多肽中可能发挥降血糖功能的活性多肽分子，本文首先从文献中调研了从燕麦中提取鉴定得到的多肽，构建了对应的燕麦多肽数据库，并基于DPP4蛋白对多肽数据库进行了虚拟筛选.随后，针对筛选获得的6个多肽分别进行了100 ns的分子动力学模拟.从模拟之后稳定结合的构象分析了不同多肽分子与DPP4的相互作用信息，并分别计算了不同多肽分子与DPP4的结合自由能.结果表明，从燕麦多肽数据库中筛选得到的多肽可以与DPP4蛋白稳定结合，其中2个多肽分子与DPP4的亲和力相对较强.本文得到的多肽分子可以作为后续DPP4抑制剂设计和改造的先导分子，燕麦多肽数据库也可用于研究燕麦的其他生物学功能.     

人溶血磷脂酸受体2基因的克隆及其在293T细胞中表达

在以前的研究中我们发现溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)通过溶血磷脂酸受体2(Lysophosphatidic acid receptor 2,LPAR2)介导促进胃癌细胞迁移.为进一步研究LPAR2介导的信号转导机制与功能,本研究试图建立过表达的LPAR2转基因细胞模型.选用人胃癌SGC-7901细胞系的cDNA经RT-PCR法克隆得到LPAR2基因CDS区,并亚克隆到pMD19-T载体,通过测序确认后、经酶切、连接到表达载体pIRES2-EGFP,酶切和测序鉴定获得pIRES2-EGFP-LPAR2重组质粒;通过LipofectamineTM2000介导把表达载体质粒转染进293T细胞.Western Blot法检测结果说明人LPAR2蛋白在293T细胞中得到表达.     

肿瘤靶向多肽生物淘选技术研究进展

生物淘选肿瘤或癌细胞的各种特异性靶向多肽是探索肿瘤早期诊断和治疗方法的有效途径.特异性靶向多肽既可用于探测肿瘤细胞表型特征,又可将其与抗癌药物结合进行靶向治疗,同时还可作为体内肿瘤的成像制剂,用于肿瘤及肿瘤细胞微转移的早期探测.噬菌体展示肽库技术能够有效地进行生物淘选或识别出与癌或肿瘤细胞某一靶点连结的,具有特异性、高亲和性的多肽.近年来,利用体内或体外噬菌体展示肽库技术已成功地淘选或识别出一些癌细胞的靶向多肽.本文就这些方面的研究进展进行了简要阐述,重点介绍了癌或肿瘤细胞靶向多肽的体外和体内生物淘选最新技术和临床应用.     

胃癌细胞活性与细胞周期相关蛋白表达相关性分析

目的 探讨胃癌细胞活性与细胞周期相关蛋白(CAPRIN1)表达的关系.方法 通过pEGFP-5X-3质粒转染人胃癌细胞SGC-7901,将上调CAPRIN1的表达设为研究组(转染pGEX-5X-3-CAPRIN1质粒),同时设置阴性对照组(转染pEGFP-5X-3空载体质粒)、空白对照组(常规培养).CCK-8法、Transwell小室检测细胞活性;Western blot法检测p-Akt、CyclinD1蛋白表达水平.结果 转染48 h后,与阴性对照组和空白对照组比较,研究组SGC-7901细胞CAPRIN1mRNA和蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);SGC-7901细胞CAPRIN1mRNA和蛋白表达水平在空白对照组与阴性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).培养96 h,SGC-7901细胞增殖水平呈上升趋势,在培养48、72、96 h时,与阴性对照组和空白对照组比较,研究组SGC-7901细胞增殖水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05).研究组的迁移SGC-7901细胞数为(604.17±58.09)个,明显多于阴性对照组的(316.92±38.78)个、空白对照组的(311.75±40.51)个,差异具有统计学意义(P<0.01).与阴性对照组和空白对照组比较,研究组SGC-7901细胞中p-Akt、CyclinD1蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 上调CAPRIN1的表达可明显提升胃癌细胞的增殖、迁移能力,可能与激活Akt信号通路和CyclinD1蛋白有关.     

多肽在丝状噬菌体外壳蛋白上的展示

利用基因工程方法将丝状噬菌体ｆｄ基因８克隆入ｐＫＫ２３３－３质粒中,将人工合成的六个氨基酸残基的多肽基因插入到修饰后的质粒载体中,并制备了杂合噬菌体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明,外源多肽基因得到了正常表达,其产物展示于丝状噬菌体的外壳蛋白上。