DNA改组在腺相关病毒定向进化中的发展及其应用

DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术, 自1994年提出以来, 经过了几十年的发展, 其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现. 腺相关病毒(adeno- associated virus, AAV)是一种细小病毒, 由于其无致病性和能有效呈递基因而成为一种非常理想的基因表达载体. 但是AAV筛除存在一些不足, 如对某些重要靶细胞感染效率不高、存在机体的免疫反应等限制了其临床研究的进展. 应用DNA 改组技术对AAV的衣壳蛋白进行定向进化, 有望解决这些问题. 本文重点综述DNA改组在AAV衣壳定向进化上的技术发展和应用, 并结合本课题组在AAV衣壳DNA改组上的研究工作展开讨论.     

腺相关病毒外壳修饰与肿瘤靶向治疗

靶向性是肿瘤基因治疗取得成功的关键因素. 在众多基因治疗病毒载体中, 腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是目前广为关注的基因治疗载体系统. AAV具有广泛的宿主范围, 这也导致其缺乏组织或细胞特异性, 对靶细胞的基因转染效率不高. 因此, 提高AAV载体在体内运输的靶向性和感染目的细胞的效率, 是实现AAV基因治疗的关键. 迄今为止, 科学家已开发出很多策略来改造腺相关病毒的外壳, 期望增强其靶向性或重靶向目的细胞. 这些策略不仅包括传统的化学修饰、噬菌体展示、外壳基因组改造和嵌合载体, 也包括新颖的标记营救、衣壳蛋白定向进化、AAV外壳直接肽段展示和AAVP (AAV-Phage)等. 本文评述了对AAV外壳改造达到靶向肿瘤细胞的研究进展.     

以EBV复制子载体为基础的新型重组AAV载体包装系统

重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是能建立稳定表达的转导型表达载体,可用作基因治疗的外源基因荷载工具.与逆转录病毒相比,它具有高安全性、无致病性和能感染有丝分裂后细胞等的特点.目前重组AAV的制备,需要两种不同的重组AAV质粒,一种是含位于AAV基因组两端的为病毒复制和包装所必需的反向末端重复(Inverted ter-minal repeats,ITR)和外源基因的重组表达质粒载体;另一种质粒作为助手质粒,克隆了除两端ITR外的AAV全基因组DNA,它反式提供AAV复制和包装所需的病毒蛋白,当这两种质粒共转染宿主细胞时,如存在辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)的感染,就能包装出含外源基因的重组AAV假病毒颗粒.     

兔出血症病毒衣壳蛋白与次级结构蛋白的相互作用

用真核细胞双杂交系统、免疫共聚焦技术和免疫共沉淀等方法,对兔出血症病毒(RHDV)的衣壳蛋白(VP60)和次级结构蛋白(VP10)在细胞内、外的相互作用进行了分析和鉴定.结果显示,RHDVVP60与VP10两种蛋白之间存在较强的相互作用,将VP60截为两大段后,其间的相互作用明显减弱,提示二者之间的相互作用依赖于衣壳蛋白结构的完整性.本研究将为进一步研究RHDV病毒颗粒的装配机制等提供有益线索.     

腺相关病毒载体的靶向策略探讨

与其他病毒载体相比, 腺相关病毒(adenovirus-associated virus, AAV)由于具有宿主范围广、病原性低和携带的治疗基因表达期长等优势而成为目前最有前景的基因转移载体之一. 然而, 在临床基因治疗过程中, AAV具有广泛的宿主范围同时也导致缺乏组织或细胞特异性, 对靶细胞的基因转染效率不高, 同时也缺乏安全性. 因此, 提高重组AAV (rAAV)的靶向能力对于基因治疗成功与否非常关键. 目前, 各种不同血清型AAVs的分离、鉴定、应用以及rAAV制备技术的发展使得rAAV载体可用于更多的临床基因治疗实验. 而且, 当前针对rAAV载体各种靶向策略的研究也显示了很好的基因治疗应用前景. 这些靶向策略主要包括转录靶向、受体靶向、共价偶联靶向、各种不同血清型AAV的应用以及基因重组靶向策略等. 本文就近年来基于rAAV载体的各种靶向策略的进展作一评述.     

利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的

利用低温电镜术和像重构方法测定了兔出血症病毒的三维结构,分辨率达到3.2nm.兔出血症病毒的三维结构显示了杯状病毒的典型特征.位于二十面体二次轴和局域二次轴位置的90个弧状突起以及位于五和三次轴位置的32个杯状凹陷排布在T=3的二十面体衣壳上.因而从结构上表明中国株兔出血症病毒属于杯状病毒科.A,B壳粒之间相互连接,并且杯状凹陷底部未见隆起.兔出血症病毒衣壳壳层区由连续蛋白密度构成,未发现病毒RNA通道存在.从低温电镜像及三维密度图中可以分辨含基因组和含亚基因组两种病毒颗粒的存在.这两种病毒颗粒衣壳结构类似.     

溴乙锭荧光探针法检测三链DNA的形成

早在1957年 Davis 等就曾报道过三链核酸的存在,但当时被认为是一种人为的没有生物学意义的结构而未引起人们的重视.直到1987年 Mirkin 等在酸性溶液的质粒中发现一种 H 型三链 DNA,同年 Dervan 等证实了可通过将第三股 DNA 粘接到含有真实基因的天然 DNA 上形成三链 DNA,才引起人们的广泛关注.目前已经发现,通过三链 DNA 的形成,寡聚核酸可以充当切割 DNA 的“分子剪刀”和提供抑制基因转录的新手段、并可能在发展治疗病毒性疾病(如爱滋病、癌症等)的新型药物等方面具有潜在的应用.鉴于这些原因,发展一种灵敏度较高的有效检测三链 DNA 形成的方法是十分有意义的.溴乙锭(以下     

一种新型的低辅毒污染的重组AAV生产系统

将Cre-loxP系统引入重组AAV的生产过程之中, 用缺陷型腺病毒AdLC作为生产重组AAV的辅助病毒. 在大量生产带有目的基因(EGFP, hFⅨ )的重组腺相关病毒载体的同时, 最大程度地限制了辅助病毒的产生, 从而减轻了下游纯化工作的压力. 活体动物实验的结果证实了这种方法的优越性. 实验结果为重组AAV载体系统在基因治疗领域中的应用提供了一条新的途径.     

利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的三维结构

利用低温电镜订和像重构方法测定了兔出血症病毒的三维结构，分辨率达到3．2nm，兔出血症病毒的三维结构显示了杯状病毒的典型特征。位于二十面体二次轴和局域二次轴位置的90个弧状突起以及位于五和三次轴位置的32个杯状凹陷排布在T＝3的二十面体衣壳上。因而从结构上表明中国株兔出血症病毒属于杯状病毒科，A，B壳粒之间相互连接，并且杯状凹陷底部未见隆起。兔出血症病毒衣壳壳层区由连续蛋白密度构成，未发现病毒RNA通道存在。从低温电镜像及三维密度图中可以分辨含基因组和含亚基因组两种病毒颗粒的存在。这两种病毒颗粒衣壳结构类似。     

大麦黄矮病毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜体内传毒相关蛋白的确定

应用双向电泳和病毒覆盖测定技术, 从大麦黄矮病毒麦二叉蚜和麦长管蚜株系(GAV)的传毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜的蛋白质提取物中检测到一种分子量为50 kD的蛋白(P50), 它与提纯的病毒有高的亲和反应. 对麦二叉蚜体内的P50进行了电泳分离并制备了家兔抗血清, 两种麦蚜饲食该蛋白的抗血清后, 传毒效率分别由对照的72.55%和73.44%下降为8.57%和28.56%, 表明该蛋白是参与病毒与介体麦蚜相互识别的传毒相关蛋白. 采用电子显微镜免疫胶体金对50 kD传毒相关蛋白进行麦蚜体内定位, 发现其存在于麦二叉蚜的头部唾液腺组织中, 揭示出麦蚜唾液附腺组织上的膜蛋白与病毒的相互识别是麦蚜能够传播大麦黄矮病毒的根本原因.     

山西介休鑫峪沟左则沟煤业有限公司水文地质类型分析

文章对山西介休鑫峪沟左则沟煤业有限公司水文地质条件进行了分析,在此基础上确定了该矿的水文地质类型.     

道路沥青砼路面平整度的控制

文章客观分析了影响路面平整度的因素,并从基层养护清理、沥青砼摊铺、压实、接缝处理及机械配备等方面阐述了保证路面平整度的措施.     

提高热风炉废气温度在安钢的应用

以实际生产为例,介绍热风炉废气温度影响的因素,及如何提高热风炉废气温度的方法和其他应用过程。     

论原平市农业机械化的发展之路

原平市采取了一系列的措施,从农机化技术推广、试验示范、树立样板典型、信息服务、投诉监督等方面探索出一条农业机械化持续发展的道路,创造了巨大的经济效益,有力地推动了农业的持续发展,为全省农机化向更健康、更层次的持续发展起到了积极的推动作用.     

钢结构施工问题浅析

文章针对结构施工中的强制性条文方面的规定进行了总结,并对钢结构的工厂制作质量控制进行了重点阐述,提出钢结构的现场安装质量控制是施工中不可忽视的重点.     

单位计算机核心服务器搭建的相关问题探索

在本单位的网络管理和维护日趋繁杂的前提下,我们迫切地需要用计算机来管理计算机,提高网络管理水平,使信息更安全、更稳定、更快捷地传递.本文主要就单位计算机核心服务器的搭建相关问题进行研究,对于进一步深化单位网络建设具有一定帮助.     

园林绿化工程施工管理探讨

文章概括了城市园林绿化的绿化施工管理现状,并深入地探讨了绿化施工管理及质量管理等城市园林绿化关键技术.     

"分析的化身"——纪念欧拉诞辰300周年

在一个小国家里诞生一位科学巨匠，这在世界史上并不多见。瑞士数学家、物理学家欧拉（L．Euler）便是其中最出色的一位，虽然他成年以后一直生活在两座遥远的异国城市：彼得堡和柏林，他的肖像画却出现在瑞士法郎上，与英镑上的牛顿（I．Newton）一起成为至今仍流通欧洲的纸币上仅有的两位科学家。     

张力减径机传动系统分析与比较

文章介绍了张力减径机的几种传动方式,并对其进行了分析与比较。     

张力减径机传动系统分析与比较

文章介绍了张力减径机的几种传动方式，并对其进行了分析与比较。