水稻单端体的获得及其分子细胞学鉴定

从籼稻品种中籼3037第1染色体短臂、第4染色体长臂及第11染色体长臂端三体的自交后代中, 选择形态性状出现明显变异但体细胞染色体数目仍为2n = 24的个体. 用水稻着丝粒特异的BAC克隆17p22为探针对有丝分裂早中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)分析, 各筛选到了一单端体植株, 其体细胞中各含有一条端着丝粒染色体. 进一步分别以位于第1染色体短臂、第4染色体长臂及第11染色体长臂上的特异分子细胞学标记a0059H02, a0034E24及a0071H11为探针, 对以上3个单端体的有丝分裂早中期染色体及减数分裂粗线期的染色体进行荧光原位杂交分析, 证明这些变异株确为第1染色体短臂、第4染色体长臂和第11染色体长臂的单端体. 这些单端体的植株矮小, 结实率较低.     

抗赤霉病普通小麦-大赖草端二体代换系7Lr#1S(7A)的选育及减数分裂行为分析

大赖草对赤霉病具有较好的抗性,将大赖草赤霉病抗性基因转入普通小麦,对拓宽小麦赤霉病抗性基础有重要意义.本研究在获得抗赤霉病普通小麦-大赖草异附加系基础上,采用1200R60Co-γ射线处理小麦-大赖草单体附加系MA7Lr花粉,授予已去雄的绵阳85-45.经分子细胞学鉴定,从M1中得到了大赖草7Lr#1S端体植株,从其自交后代中选育出一对7Lr#1S端着丝粒染色体代换了1对7A染色体的端二体代换系.筛选出共显性EST-SSR分子标记-CINAU31.对该代换系花粉母细胞减数分裂期染色体进行分子原位杂交和染色体配对分析,MⅠ的染色体构型为17.50IIW 2.19IIW 0.42II7Lr#1S 1.08Ⅰ7Lr#1S 0.69ⅠW,2条端着丝粒染色体在MⅠ配成二价体的花粉母细胞PMC占观察总数的59.7%.在后期Ⅰ和末期Ⅰ端着丝粒染色体7Lr#1S常出现特殊的染色体行为,可观察到2条端着丝粒染色体移向一极、端着丝粒染色体落后、端着丝粒染色体的姊妹染色单体提前分离等方式,从而产生了3种不同类型的四分体,且在一些四分体中有数目不等的微核出现.但由于端二体代换系产生的7Lr#1S雌雄配子有较高的传递率,保证了该端二体代换系较好的遗传稳定性,其自交后代中84%的植株为端二体代换.两年大田、温室赤霉病接种鉴定,对赤霉病表现出较高的抗性,表明该端着丝粒染色体携有赤霉病抗性的主效基因.因此,端二体代换系可作为外源基因定位、功能分析、端体细胞学行为研究的良好材料,同时也可作为进一步创造小片段易位的重要资源.     

运用cDNA缩减杂交法克隆水稻花粉发育有关的cDNA

花粉母细胞减数分裂期是花粉发育和形成的一个重要时期 .为了克隆此时期水稻花粉发育的基因 ,以可育系安农N及其温敏核雄性不育突变体安农S 1为材料 ,先抽提花粉母细胞减数分裂期幼穗的mRNA ,然后采用cDNA缩减杂交法 ,成功地克隆了RP 1 ,RP 2和RP 33个cDNA .Northern杂交分析表明 ,这 3个cDNA相对应的mRNA都只在花药中表达 ,而不在叶中表达 ,而且在安农S 1中的表达量 ,也明显低于在安农N中的表达量 .其次 ,在高温 (≥ 2 8℃ )下生长的安农S 1的表达量也明显低于在较低温 (≥ 2 5℃ )下生长的安农S 1 .经序列同源性分析 ,尚未发现与RP 1 ,RP 2和RP 3序列同源的基因 .以上结果显示这 3个是新的与水稻花粉发育有关的基因     

普通小麦-大赖草染色体相互易位系T7DS•5LrL/ T5LrS•7DL的分子细胞遗传学研究

利用800R剂量⁶⁰Co-γ射线处理处于减数分裂期的普通小麦-大赖草二体异附加系DA5Lr的大孢子母细胞, 开花前去雄套袋, 授予普通小麦“中国春”的花粉. 对M1种子根尖细胞有丝分裂中期染色体进行GISH分析, 得到1株含有2条分别涉及5Lr长臂和短臂的易位染色体植株. 将其与二体附加系DA5Lr测交, 对测交后代中含有1条5Lr和2条易位染色体植株的花粉母细胞减数分裂行为进行分析, 在双线期观察到2条易位染色体和1条5Lr及1条小麦染色体联会成“十”字形构型, 中期Ⅰ形成“Z”字形或环状四价体, 表明这2条易位染色体为相互易位染色体. 染色体C分带结果显示, 易位涉及的小麦染色体可能为A组或D组染色体, 用pSc119.2和pAs1专化探针分别与其进行染色体荧光原位杂交, 易位染色体中的小麦染色体片段上显现出较强的pAs1(对D染色体组专化)杂交信号, 根据pAs1标准染色体分子核型, 结合C分带结果, 易位涉及的小麦染色体为7D, 相互易位染色体为T7DS•5LrL/ T5LrS•7DL. 该相互易位杂合体的配子传递分析表明, 2条相互易位染色体常常一起传递, 通过雌、雄配子的传递率分别为59.4%和83.9%, 表现出花粉优先传递特征. 在相互易位杂合体自交后代中, 除分离鉴定出相互易位纯合系之外, 还获得纯合易位系T7DS•5LrL, 该易位系对赤霉病有较好抗性, 为小麦赤霉病抗性改良提供了一种新种质.     

白芥×甘蓝F1代及BC1代单体异附加系的GISH分析

以白芥(Sinapis alba L)为母本, 甘蓝(Brassica oleracea var alboglabra)为父本进行属间杂交, 获得了不育及半不育的两种F₁植株, 再以半不育的F₁植株作母本, 甘蓝作父本进行回交, 获得了BC₁植株. 利用基因组原位杂交(genomic in situ hybridization, GISH), 结合双色荧光原位杂交(dual-colour fluorescence in situ hybridization, dcFISH)技术, 鉴定出不育F1植株有21条染色体, 其中9条来自甘蓝, 12条来自白芥, 属含1套甘蓝染色体及1套白芥染色体的预期杂种; 半不育F1植株有30条染色体, 其中18条来自甘蓝, 12条来自白芥, 属含2套甘蓝染色体及1套白芥染色体的非预期杂种, 其花粉母细胞(PMC)减数分裂中期Ⅰ最多出现3个C-S三价体, 减数分裂后期Ⅰ白芥染色体出现不同的分离比例. GISH分析结果表明, 从BC₁植株中鉴定出了1株甘蓝-白芥单体异附加系, 其有丝分裂中期相有19条染色体, 18条来自甘蓝, 附加的1条来自白芥; 减数分裂中期Ⅰ显示9个甘蓝的二价体及1个白芥的单价体, 有时白芥的单个染色体与甘蓝的染色体形成了可能的三价体. 甘蓝-白芥单体异附加系的获得为白芥基因渗入、基因定位与克隆奠定了基础.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

用Giemsa显带技术研究继代培养玉米花粉愈伤组织无性系的染色体组型

近年来,在高等植物中广泛开展Giemsa显带技术的研究和应用。尽管玉米在细胞学和遗传学方面曾进行过大量深入的研究,但目前应用Giemsa显带的报道还少。Ward和等人通过Giemsa显带证明,玉米体细胞有丝分裂中期染色体上显现的深色带区是与花粉母细胞减数分裂粗线期染色体上的染色结相一致。因为染色节就是异染色区。关于玉米染色体上异染色结首先被Mcclintock所描述。可以利用异染色质结的特征作为识别     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

再生肝细胞中出现37ku的ACA蛋白抗原

动粒(kinetochore)位于染色体主缢痕处,是细胞有丝分裂、减数分裂时纺锤体微管附着的地方,是有丝分裂和减数分裂中对染色体的正常分离和运动所必需的.ACA(Anti-centromere/kinetochore antibody)在CREST硬皮病病人血清中的发现,大大促进了人们对动粒结构、组成及功能等的研究.ACAs不仅和有丝分裂、减数分裂细胞的动粒结合,而且和间期细胞的前动粒(prekinetochore)结合.     

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中, 根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子. 结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化. 水稻是重要的粮食作物, 能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素. 将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因b-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2BP-GUS, 以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记. 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统, 获得了携带嵌合基因Gmenod2BP-GUS的水稻再生植株. 以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针, 检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2BP-GUS的表达. 结果表明, 转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导, 仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达, 并且受到氮源的调控. 推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.     

小麦-冰草附加系1•4重组P染色体对Ph基因的抑制作用

冰草属(Agropyron Gaertn.)的P组染色体被推测可能携带有抑制小麦Ph基因的遗传系统, 但是相关的研究很少. 本研究发现, 在小麦-冰草附加系Ⅱ-21-2(附加1•4重组P染色体)的减数分裂中存在染色体联会异常的现象. 对该附加系进行细胞遗传学和Ph1基因扩增等分析与检测, 结果表明附加系Ⅱ-21-2的Ph1基因扩增正常, 未见缺失; 小麦-冰草附加系Ⅱ-21-2减数分裂中期每个花粉母细胞出现六价体或四价体的数目分别为0.41和0.13, 而附加系受体小麦Fukuho减数分裂无染色体异常联会. 双色GISH/FISH检测表明, 附加系Ⅱ-21-2的P染色体不直接参与多价体的组成, 多价体为小麦自身染色体构成. 附加系Ⅱ-21-2的1•4重组P染色体能够抑制小麦Ph基因的作用, 从而引起小麦部分同源染色体之间的联会, 并造成包括小麦3B-3D等部分同源染色体之间的易位. 小麦-冰草附加系的P染色体促进小麦部分同源染色体联会的作用或特性在未来小麦的遗传改良中具有潜在应用价值.     

利用人工控制细胞死亡策略培育抗稻瘟病水稻

利用细菌编码RNase的barnase 基因及其特异抑制剂编码基因barstar构成的双元组分系统, 把本实验室构建的具有稻瘟菌(Magnaporthe grisea)诱导活性的嵌合启动子与barnase基因融合, 再与由CaMV 35S启动子驱动的barstar的构件融合, 构建植物表达载体pWBNBS和pPBNBS, 转化水稻, 并对转基因水稻进行了抗稻瘟病和白叶枯病的检测. 结果表明, 接种稻瘟菌后, 转基因水稻植株中barnase基因受诱导表达; 在稻瘟菌侵染诱导下, barnase的表达超过barstar的抑制, 导致转基因水稻叶片出现类似过敏感应, 表现出对稻瘟病的抗性; 转基因水稻对白叶枯病表现出一定的抗性. 这些结果说明, 通过该双元组分系统策略获得的转基因水稻具有明显的抗致病性真菌和一定程度的抗细菌危害的较广谱抗性.     

从花粉肌动蛋白到作物雄性不育

肌动蛋白在动植物细胞的生命活动中担负着重要任务. 花粉细胞中含有丰富的肌动蛋白,其结构及性质与动物肌动蛋白极其相似. 植物肌动蛋白基因的碱基序列及氨基酸序列与动物的序列亦极为相似. 植物细胞质雄性不育系植株的花粉比其保持系花粉中的肌动蛋白含量低得多. 在植物发育过程中肌动蛋白基因的表达有明显的器官特异性,在花粉中的表达量比根、茎、叶中高得多. 构建了肌动蛋白反义基因的表达质粒,转移到小麦和番茄原生质体中,以抑制花粉中肌动蛋白基因的表达,从而获得雄性不育植株. 转基因植株花粉中的肌动蛋白明显减少,而雌芯却不受影响. 此项研究为培育作物雄性不育系开辟了新途径.     

C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

染色体分离的分子机理

染色体分离是有丝分裂和减数分裂的关键事件, 是保证姊妹(同源)染色体正确分配到子细胞中关键的调控环节之一. 近年来, 利用酵母等真核模式生物突变体, 研究人员克隆了一些调控细胞分裂早期姊妹染色体黏着和后期黏着素酶解的关键基因, 初步阐明了染色体分离的分子调控机理. 由多亚基蛋白组成的黏着素是保证染色体正确黏着和分离的关键分子. 在细胞分裂中后期过渡时, 经过一系列的分子识别和互作导致黏着素蛋白选择性地降解, 使染色体分离. 本文在详细地讨论了参与有丝分裂染色体分离调节的关键蛋白质及其作用机制的基础上, 简单介绍了有丝分裂和减数分裂染色体分离过程中分子调节的差异, 并分析了染色体分离分子机制研究中尚待解决的关键问题.     

水稻花优势表达基因RA68的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻花中克隆了1个编码含丰富脯氨酸和苏氨酸结构域多肽的cDNA, 其相应的基因命名为RA68. RA68含3个外显子和2个内含子, 编码由219个氨基酸残基组成的蛋白质. 数据分析结果显示, 该蛋白由1个22个氨基酸残基组成的信号肽, 1个亲水性的N-端结构域和1个疏水性的C-端结构域组成. N-端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列. Southern blot和序列分析结果表明, RA68在水稻基因组以单拷贝存在, 定位于第2号染色体. Northern杂交结果表明, RA68在幼芽和花中表达量较高, 在根和叶中不表达. 花和幼芽进行原位杂交分析结果表明, 在花中, RA68在花粉母细胞、二分体细胞、单核花粉粒以及大孢子囊中表达. 基于该基因的表达特性及其编码蛋白质的结构特征, 探讨了其在花发育中的可能功能.     

动点马达蛋白CENP-E通过Nuf2蛋白维系染色体与微管作用的可塑性

在细胞有丝分裂过程中,包含在染色体中的父代遗传信息在经历诸多复杂的运动后均等地传递给两个子细胞.整个细胞分裂过程是通过纺锤体微管与染色体着丝粒的协同作用来完成的.正确的染色体与纺锤体微管相互作用是细胞健康的保证,同时染色体与纺锤体微管连接异常导致染色体不稳定性从而使细胞生长失控.     

水稻赤霉素20-氧化酶基因(rga5)的正、反义转化对水稻生物学性状的影响

通过PCR方法从水稻"矮子占"和"南特号"的基因组DNA中分离出赤霉素20-氧化酶基因rga5, 其编码区含1119 bp. 其编码蛋白与已报道的水稻赤霉素20-氧化酶基因OsGA20ox相比有11个氨基酸不同, 其中9个氨基酸为移码差异. 通过基因枪法将该基因的正、反义表达质粒pSrga5和pArga5转化水稻"中花8号", 获得了生物学性状有明显变异的转基因植株. 正义转化表现出植株增高、叶片和穗变长、穗粒数增加等特征, 但花期未受明显的影响; 而反义植株表现出明显的"矮化"和"早花", 且出现植株细弱、叶色加深、叶片和穗变短等特征. 转基因水稻的分析结果表明, rga5正、反义外源基因已分别整合到水稻基因组中, 并有效表达; 正义植株体内的GA1平均增加约50%, 反义则降低至对照组的约10%. 结果表明, rga5是水稻赤霉素合成代谢途径中起关键作用的赤霉素20-氧化酶基因, 该序列中11个氨基酸的变异并不影响其功能. 正义表达可增强体内GA的合成, 促使植株生长, 增加株高; 反义转化则抑制了内源GA的合成及植株生长, 导致植株明显的矮化.     

抗白粉病小麦-中间偃麦草(Thinopyrum intermedium,2n = 42)异附加系的选育及分子细胞遗传鉴定

利用中间偃麦草与普通小麦烟农15杂交，通过细胞学及白粉病人工接种，在杂交后代中鉴定筛选到了2个细胞学稳定的二体异附加系Ⅱ-1-7-1和Ⅱ-3-3-2，其根尖细胞染色体数为2n=44，花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ一般能形成22个二价体，与普通小麦杂交，F1PMCMⅠ一般出现1个单价体，利用白粉病15号菌种及混合菌种进行温室及田间抗病性鉴定表明它们对白粉病表现免疫，异附加系与小麦杂交F2单株染色体数及抗病性鉴定表明，抗性基因位于外源染色体上，以St和E基因组DNA为探针进行原位杂交发现，2个异附加系附加的染色体可能来自E染色体组，表明E染色体组的一对染色体携带一个新的抗白粉病基因。     

抑制表达谷氨酰胺合成酶基因对水稻氮代谢和生长发育的影响

从明恢63平衡化cDNA文库中获得水稻GS2基因的cDNA克隆, 通过基因克隆和农杆菌介导的水稻遗传转化方法将GS2基因导入中花11进行超量表达. 对获得的转基因植株进行生长表型和基因表达、生理生化指标测定与分析. 结果显示, T₁代转基因植株由于GS2的抑制表达出现黄化现象, 生长受到限制; 叶片叶绿素含量与GS2基因的表达量紧密相关; 植株中大多数氮代谢、叶绿素合成和光呼吸途径中相关基因表达量上升; 而植株的氮代谢水平下降, 包括GS活性、水溶性蛋白和氨基酸含量.