细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

纹皮蝇Hypodermin B基因在大肠杆菌中的表达

从纹皮蝇Ⅰ期幼虫中提取总RNA,RT-PCR扩增纹皮蝇Hypodermin B(HB)基因.将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达载体pET30-HB,转化大肠杆菌BL21(DE3).用IPTG诱导表达后,得到表达量达全菌蛋白30%以上的特异性蛋白.SDS-PAGE分析表明表达产物主要以包涵体形式存在.Western blotting检测结果表明,获得的重组蛋白为重组Hypodermin B,具有较好的反应原性.     

播娘蒿DsCOR基因的原核表达、蛋白纯化、及性质研究

利用PCR方法扩增DsCOR基因的蛋白编码序列，经BarnH Ⅰ、Sac Ⅰ酶切后连接入pET32a原核表达载体，构建的pET32a—DsCOR融合重组表达质粒转化大肠杆菌BL21进行原核表达．建立了“煮沸-镍离子亲和层析”的蛋白纯化方法．对纯化的DsCOR蛋白进行高温耐受性、pH耐受范围、紫外耐受性方面的研究．     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

东亚三角涡虫Dj14-3-3ε原核表达及鉴定

从东亚三角涡虫cDNA文库中挑选出克隆M455,经BLASTP确定隶属于14-3-3ε基因家族,具有14-3-3蛋白的保守结构域命名为Dj14-3-3ε基因.该基因含有完整的最大开放阅读框(ORF),编码蛋白约10.7 kDa.构建pET28b-Dj14-3-3ε原核表达载体,通过IPTG诱导在大肠杆菌中表达,western blot鉴定,表明原核表达载体构建成功,并在大肠杆菌中正常表达.     

家鸡TSHβ、FSHβ和LHβ重组蛋白表达及纯化研究

本文以家鸡冷冻垂体组织为模版,克隆了TSHβ、亚基FSHβ亚基和LHβ亚基的部分特异性功能片段,并用pET原核表达系统构建了它们的原核表达质粒:pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ.利用大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami TM菌株摸索到高效重组表达pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ的IPTG诱导浓度分别为:200μM、25μM和15μM.并在此基础上利用镍离子亲和层析蛋白纯化技术对重组蛋白进行了纯化.     

小鼠肥大细胞蛋白酶4的原核表达和多克隆抗体制备

文章构建小鼠肥大细胞蛋白酶4（mMCP-4）原核表达体系,获得原核表达蛋白,并制备兔抗mMCP-4多克隆抗体,提取小鼠脾细胞总 RNA ,运用 RT-PCR技术获得目的基因 mMCP-4,构建重组原核表达载体pET28a-mMCP-4,将其转化到大肠杆菌BL21中诱导表达。mMCP-4融合蛋白经Ni亲和层析法纯化后,作为抗原免疫兔子获得mMCP-4多克隆抗体。采用ELISA法测抗体效价,western blot检测抗体特异性。结果表明,构建重组表达质粒pET28a-mMCP-4,经大规模原核表达获得大量mMCP-4融合蛋白,制备的兔抗血清效价达1∶128000,并表现出较好特异性。研究结果为进一步研究mMCP-4生物学功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的表达与纯化

根据GenBank报道的PRRSV VR2332基因序列设计引物,经RT - PCR扩增,得到大小约为390 bp的阳性产物;利用Bam H Ⅰ,EcoR Ⅰ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE,Western blot分析.结果表明:克隆的N蛋白基因与GenBank报道的VR2332基因同源性为93.83％;重组菌株经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;经筛选得到最佳诱导条件,即1 mmol/L IPTG诱导6h,蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635％,SDS-PAGE后切胶回收可得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础.