水稻线粒体tRNATrp的种属特异性氨酰化

为了研究原核生物和真核生物(细胞质)色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)对线粒体tRNA^Trp识别的种属特异性, 构建了7个水稻线粒体tRNA^Trp三位点(G73, U72, A68)的单点或多点突变的突变体. 这些突变基因, 经体外转录后分别用枯草杆菌(B. subtilis)和人色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)进行氨酰化反应, 并测定它们的动力学常数. 结果表明, 与野生型水稻线粒体tRNATrp相比, 7个突变体的转录产物被B. subtilis TrpRS氨酰化的活力分别降低了53.33%~99.79%, 被人TrpRS氨酰化的活力却分别提高了4~330倍, 其中以MPH7(水稻线粒体tRNATrp的三碱基(G73, U72 和C68)全部突变为人tRNA^Trp的三碱基序列)的氨酰化活力改变最大. 实验结果证明, 与真核生物和原核生物细胞质tRNA^Trp的种族特异性类似, 水稻线粒体 tRNA^Trp的种属特异性元件也主要处于氨基酸接受茎的识别位碱基、第一和第五对碱基对, 亦即识别位碱基G73, 氨基酸接受茎上的两个碱基对G1/U72和U5/A68. 本研究为线粒体 tRNATrp起源于真细菌的推论提供了实验依据.     

枯草杆菌TrpRS与小螺旋DNA的紫外光定点交联

为研究枯草杆菌色氨酰－tRNA合成酶（TrpRS）与小螺旋DAN的相互识别及其结构与功能的关系，人工合成了4种小螺旋DNA（其中3种在不同位点带有光化学交联试剂s^4T），纯化了枯草杆菌TrpRS，设计制作紫外交联仪，进行了TrpRS与小螺旋DNA的紫外光定点交联实验，优化了紫外交联条件，实验结果表明，小螺旋DNA分子中对应于tRNAT^rp73，72位的碱基与TrpRS有直接的相互作用，而对应于tRNA^Trp55位的碱基与TrpRS无直接的相互作用，紫外交联产物的量与紫外光照射剂量、TrpRS浓度、小螺旋DNA浓度呈正相关。