拟穴青蟹CrusSp的克隆表达纯化及抑菌活性测定

从拟穴青蟹血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增编码CrusSp成熟肽的cDNA序列,将其克隆至pMD18-T载体进行扩增,然后克隆至pET-32a(+)表达载体中,转化至E.coli OrigamiTM(DE3)中表达CrusSp蛋白,通过Ni2+亲和层析柱纯化获得CrusSp蛋白,表达出的CrusSp蛋白分子量约10.27 kDa,等电点为8.54,采用滤纸片扩散法检测该蛋白的抑菌活性.滤纸片扩散法显示CrusSp蛋白对绿色木霉具有抑制活性.     

拟穴青蟹抗菌肽CrusSp基因克隆表达及抑菌活性分析

从拟穴青蟹血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增编码CrusSp成熟肽的cDNA序列,克隆至pET-32a(+)表达载体中,转化至王coli OrigamiTM(DE3)中表达CrusSp蛋白,通过Ni2+亲和层析柱纯化获得CrusSp蛋白,表达出的CrusSp蛋白相对分子量约10.27 ku,等电点为8.54,滤纸片扩散法结果显示CrusSp蛋白抑制绿色木霉.     

拟穴青蟹新型抗菌肽的发现、研究与应用进展

水产养殖业长期过量使用抗生素导致的细菌耐药性增加、水产品中抗生素残留和养殖环境中抗生素污染等问题,已严重影响我国水产养殖业健康发展,因而亟需寻找抗生素的有效替代品.抗菌肽是一类生物体中普遍存在并具有广谱抗微生物活性的小分子多肽,因其不同于传统抗生素,具有不易产生耐药性等特性,被科学家誉为"天然抗生素".海洋无脊椎动物是...     

拟穴青蟹HSP70基因的克隆与组织表达

热休克蛋白70(HSP70)是一种重要的功能蛋白.利用RACE和基因克隆等分子生物学技术,获得拟穴青蟹(Scylla paramamosain)HSP70全长cDNA序列,全长共2 189 bp,包括110 bp的5′UTR(untranslated regions)、126 bp的3′UTR和一个1 953 bp的开放阅读框(ORF).ORF可编码650个氨基酸残基,总分子质量约为71.2 ku,pI为5.38.同源蛋白的比较结果显示,拟穴青蟹HSP70序列与其他一些物种具有很高相似性,推测HSP70基因具有很高的遗传保守性,而基于HSP70氨基酸序列比对而绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测雌性拟穴青蟹一些组织中的HSP70表达,结果显示各待测组织中均能扩增得到HSP70,说明HSP70在拟穴青蟹为组成型表达.其中,HSP70在卵巢中表达量最高,其次为脑神经节,推测这与HSP70作为分子伴侣的功能相关.     

拟穴青蟹群体遗传多样性的ISSR分析

采用ISSR技术对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)3个地理群体:福建群体(FJ)、广西防城港群体(FC)和北海群体(BH)的遗传多样性进行检测.用10对ISSR引物对90个个体进行PCR扩增,用POPGENE32计算遗传参数,并用ARLEQUIN软件进行AMOVA分子变异分析.结果共检测到63个位点,多态位点数为56.福建、防城港和北海群体Neis基因多样性指数(He)分别为0.2670、0.1819和0.2257,Shannon's信息指数(Ⅰ)分别为0.3945、0.2708和0.3371,遗传多样性水平从高到低依次为FJ＞FC＞BH.He和Ⅰ在群体水平上分别为0.2248和0.3341,在物种水平上分别为0.3186和0.4337.拟穴青触32.34％的变异发生在群体间,67.66％的变异发生在群体内,3个群体间的遗传分化系数为0.1542,产生了一定的遗传分化.     

拟穴青蟹细丝蛋白C的生物信息学分析及重组表达

为了探讨抗原表位与细丝蛋白C(filamin C,FLN c)结构之间的构效关系,对FLN c进行生物信息学分析及分段重组表达。生物信息学分析结果表明,FLN c二级结构以β折叠及无规则卷曲为主,确定其具有9个结构域,三级结构呈免疫球蛋白样折叠,具有典型的细丝蛋白家族特征。基于生物信息学分析,将拟穴青蟹(Scylla paramamosain)FLN c通过分段原核表达,纯化出带有麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)标签的重组表达蛋白rFLN c1(AA:1-335)、rFLN c2(AA:336-531)、rFLN c3(AA:532-847)。血清学分析结果显示,rFLN c2与蟹类过敏患者血清IgE结合能力最强,推测此区域含有大部分抗原表位。因此,定位拟穴青蟹FLN c氨基酸336-531结构域为抗原表位优势区,rFLN c2可用于FLN c的晶体学研究。     

拟穴青蟹凝集素基因Splec1的克隆及原核表达载体的构建

为获得高表达拟穴青蟹(Scyiia paramamosain)凝集素(Lectin) Splec1的工程菌,本实验根据GenBank中凝集素的基因序列,设计合成1对扩增Splec1基因完整ORF的特异性引物,采用RT-PCR技术从拟穴青蟹血液中分离扩增了Splec1的eDNA序列(495 bp),将该基因重组到原核表达载体pET32a(+)中,酶切和测序分析表明,重组质粒pET32a(+)-Splec1结构正确.     

拟穴青蟹新型过敏原磷酸丙糖异构酶的鉴定分析

利用硫酸铵盐析和柱层析对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)进行处理,纯化得到28 ku的新型过敏原蛋白,经质谱鉴定为磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase,TIM）,与中华绒螯（Eriocheir sinensis）TIM序列相似度达到93%。该过敏原蛋白能够与甲壳类过敏患者血清和兔抗克氏原螯虾多克隆抗体发生特异性反应,等电点为5.8。对热处理稳定,加热温度高于50 ℃时发生聚合,且多聚体仍具有免疫结合活性,pH＞9.0时,对TIM免疫结合活性略有影响。在模拟胃肠液消化过程中,TIM耐受胰蛋白酶消化但不耐受胃蛋白酶消化,模拟胃液消化后的小分子片段仍保留有IgG结合活性。综合血清学及性质分析,该磷酸丙糖异构酶是拟穴青蟹的一种新型过敏原。     

pH胁迫下拟穴青蟹体内腺苷三磷酸磷酸酶活性的响应

采用酶学分析的方法研究pH(4.5、6.0、7.5、9.0、10.5)胁迫下拟穴青蟹鳃、肌肉和肝胰腺中ATPase、AKP和ACP活性的响应.以pH6.76±0.3的海水组为对照组.结果表明,随pH胁迫强度加大,拟穴青蟹鳃Na ·K -ATPase活性显著增强(p<0.05),Ca 2 ,Mg 2 -ATPase活性变化不显著(p0.05);随pH胁迫时间延长,各组拟穴青蟹鳃Na ,K -ATPase和Ca 2 ,Mg 2 -ATPase活性均在胁迫第3天出现峰值.肌肉AKP活性对照组显著高于各处理组(p<0.05),pH4.5组肝胰腺AKP活性低于对照组,其余各组均略高于对照组(p9.05);pH6.0组和pH10.5组肌肉ACP活性显著低于对照组(p<0.05);肝胰腺ACP活性,pH9.0组和pH10.5组显著高于对照组(p<0.05),pH7.5组显著低于对照组(p<0.05),pH4.5组、pH6.0组与对照组差异不显著(p0.05).随着pH胁迫时间延长,拟穴青蟹肌肉和肝胰腺AKP和ACP活性在相同pH处理组变化规律不明显,但表现出时问效应性.由此可见,pH胁迫显著影响拟穴青蟹的生理生化效应.     

铬胁迫对拟穴青蟹体内磷酸酶活性的影响

采用生态毒理学方法,研究了水体中Cr6+(0.5,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/L)胁迫1,3,5,7,9 d后对拟穴青蟹鳃、肌肉和肝胰腺中磷酸酶活性的影响,以未添加Cr6+的自然海水组为对照组.结果表明,Cr6+胁迫1 d后拟穴青蟹鳃中酸性磷酸酶(ACP)活性显著升高(p0.05),肝胰腺、肌肉中ACP活性升高不显著(p0.05),Cr6+胁迫9 d后,2.0,4.0,8.0mg/L Cr6+浓度组拟穴青蟹肝胰腺中ACP活性显著降低(p0.05).5 d后不同Cr6+浓度组拟穴青蟹鳃中碱性磷酸酶(AKP)活性一直显著升高(p0.05),胁迫9 d后,0.5,1.0,2.0 mg/L Cr6+浓度组与对照组差异不显著(p0.05),4.0,8.0 mg/L Cr6+浓度组鳃中AKP活性仍显著高于对照组(p0.05).2.0,4.0,8.0 mg/L Cr6+浓度组肝胰腺、肌肉中AKP活性在Cr6+胁迫1 d后显著升高(p0.05).Cr6+胁迫显著影响拟穴青蟹生理生化效应.     

小麦叶绿体psbA基因的克隆及表达

用ＰＣＲ直接从小麦叶绿体基因组扩增到完整的ｐｓｂＡ基因，并构建了ｐｓｂＡ基因的克隆ｐＴＤ１Ⅱ。为研究ｐｓｂＡ基因在Ｅ·ｃｏｌｉ中的表达，将完整的ｐｓｂＡ基因正向插入高表达载体ｐＫＫ２２３－３中构建表达克隆ｐＫＴＤ１。含有重组表达质粒的转化细胞经ＩＰＴＧ诱导后提取总蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，小麦叶绿体ｐｓｂＡ基因能在Ｅ·ｃｏｌｉ中表达３２ｋＤ的Ｄ１蛋白，表达的Ｄ１蛋白占细菌总蛋白的３％以上。     

人rabl3基因克隆和表达

以人的胚胎ｃＤＮＡ为模板,用ＰＣＲ方法筛选获得ｒａｂ１３基因,并克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３和原核表达载体ｐＧＥＸ、ｐＥＴ－１５ｂ和ｐＭＡＬ－ｃ２中,把ｒａｂ１３基因转染入牛肾上腺毛细血管内皮细胞（ＢＣＥ细胞）中,免疫荧光染色显示Ｒａｂ１３定位于ＢＣＥ细胞胞质内膜性细胞器上,在为ｒａｂ１３基因对膜通道调节功能的进一步研究打下了基础。     

抗肿瘤因子内皮抑素基因的克隆及表达

为了克隆抗肿瘤因子内皮抑素基因并表达内皮抑素蛋白,从人胎盘组织中分离总ＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增出５７０ｂｐ的ＤＮＡ片段,并成功地克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,经序列测定证实为内皮抑素基因,用Ｘｐｒｅｓｓ本外表达了内皮抑素蛋白并纯化成功。     

甘蓝磷酯酶D HKD2功能区基因片段的克隆与反义表达载体的构建

以甘蓝(Brassiaca oleracea)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,以cDNA第一链为模板,通过PCR扩增,获得甘蓝磷酯酶D(Phosphorate　Lipid　Dehydrolase,PLD)HKD2功能区的基因片段．对其进行Blast分析,结果表明,分离的目的片段核苷酸序列与Genbank中报道的甘蓝PLD基因相比同源率为99．7％,只有2个碱基发生改变．将得到的PLD基因片段插入植物表达载体pAT940,构建了PLD基因反义表达载体pATC—rPLD,为下一步进行抗逆转基因作物选育打下基础．     

Bti cryIVB基因的克隆及表达质粒的构建

采用ＰＣＲ方法,克隆得到３．５ｋｂ的开放阅读框架（ＯＲＦ）,其包括Ｂｔｉ的杀虫蛋白基因,ｃｒｙＩＶＢ结构基因各部分上游启动区。将结构基因亚克隆到高表达载体ｐＱＥ５２中,构建了高表达质粒ｐＱＥ５２Ｂ。在Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧ１３００９（ｐＲＥＰ）中,１３０ｋＤ的蛋白得到表达,其对韭菜迟眼蕈蚊（Ｂｒａｄｙｓｉａ ｏｄｏｒｉｐｈａｇａ）三龄幼虫具有较强的毒杀作用。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术扩增得到来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因片段，并构建重组质粒pUC-T-GDH，然后将基因片段克隆于大肠杆菌表达载体pBV220中．得到表达质粒pBV-GDH．葡萄糖脱氢酶在含有表达质粒的基因工程菌株中得以诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳及薄层扫描结果表明，经诱导表达的葡萄糖脱氢酶约占基因工程菌株总蛋白的45％．葡萄糖脱氢酶活力测试表明，基因工程菌株无细胞抽提液中葡萄糖脱氢酶的活力为7.8U／毫克，约为对照组的30倍．实验结果初步说明，广泛应用于工业化生产的葡萄糖脱氢酶可以在基因工程菌株中得以大量表达并维持较高活力．     

马铃薯低温启动子CIP的克隆及其功能鉴定

合适的启动子有利于基因的高效表达．本研究从鄂马铃薯-3中克隆了低温诱导的启动子（CIP）,并调控转化酶抑制子基因转化马铃薯植株,以抑制马铃薯块茎发生的“低温糖化”．实验结果表明,克隆的CIP与报道的低温诱导的启动子序列同源性达98．9％,含有启动子的典型结构．构建CIP与转化酶抑制子（St-VIF）基因的载体成功转化马铃薯并获得转基因株系．转基因株系收获块茎在4℃和20℃贮藏lm,Nothern杂交显示St-VIF基因在4℃大量表达,检测转化酶活性表明,与对照比较液泡转化酶活性大大降低,说明通过低温诱导CIP调控St-VIF基因的表达能够抑制转化酶的活性,从而降低还原糖的积累．     

大鼠CuZn—SOD cDNA的克隆及高效表达

采用PCR技术,扩增大鼠CuZn-SOD cDNA,双酶切后与表达载体pBV220连接,构建出表达质粒pBV-RCS,并转化大肠杆菌DH5α,经金属离子和42℃诱导,pBV-RCS得到高表达,经SDS－PAGE及薄层扫描测定表达蛋白占菌体总蛋白的49％,是目前国内外SOD高表达菌株之一^[1,2],表达蛋白以包涵体形式存在于菌体内,经超声波破壁后,再经透析复性和稀释复性,表达蛋白具有特异性SOD酶活性（1298U/mL)。α     

rcan1-1l基因的克隆和表达

从小鼠脑组织中通过总mRNA的提取、RT-PCR方法,利用pEASY-T1载体克隆出了鼠源rcan1-1l基因,并构建出了重组有rcan1-1l基因的PET21a原核表达质粒,进行了表达条件的初步摸索,这为今后研究rcan1-1l基因以及蛋白的结构与功能打下了前期实验基础.     

蜡质芽孢杆菌酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆及序列分析

利用pMD18-T克隆载体从蜡质芽孢杆菌菌株T—HW3中克隆了酰基高丝氨酸内酯酶基因（AHL—lactonase，aiiA）。测序结果表明，该基因（GenBank登录号为DQ000643）由753个碱基组成，编码含有250个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质的推测的分子量为28kDa，等电点为4．235左右。核苷酸序列的BLAST分析结果表明，与之同源性较高的基因均为蜡质芽孢杆菌组aiiA基因（86％-99％）。