水稻bZIP蛋白REB与水稻中sbe1和waxy基因5''''上游区的相互作用

水稻淀粉分支酶（SBE1）和结合淀粉粒的淀粉合成酶（GBSS）分别负责水稻胚乳中支链淀粉与直链淀粉的合成,编码这两个酶的sbel和waxy基因主要都在胚乳中表达.在水稻sbel基因5＇上游区中找到了一个能与水稻胚乳核蛋白结合的53bp片段C53,而且这种结合受到水稻waxy基因5＇上游区的Ha-2片段竞争.进一步的实验证明水稻bZIP蛋白REB可以结合sbel基因中C53片段中的2个ACGT元件G-box和Hex,并且REB也能结合waxy基因中Ha-2片段的3个ACGT元件:WG1,WG2和 WG3,其中WG1元件能强烈地竞争Hex元件与REB蛋白的结合.这提示水稻sbel基因与waxy基因在胚乳中的表达受到像REB这样的bZIP类转录因子的协同调控.     

水稻bZIP蛋白REB与水稻中sbe1和waxy基因5′上游区的相互作用

水稻淀粉分支酶（SBE1）和结合淀粉粒的淀粉合成酶（GBSS）分别负责水稻胚乳中支链淀粉与直链淀粉的合成,编码这两个酶的sbel和waxy基因主要都在胚乳中表达,在水稻sbel基因5′上游区中找到了一个能与水稻胚乳核蛋白结合的53bp片段C53,而且这种结合受到水稻waxy基因5′上游区的Ha-2片段竞争,进一步的实验证明水稻bZIP蛋白REB可以结合sbel基因中C53片段中的2个ACGT元件G－box和Hex,并且REB也能结合waxy基因中Ha-2片段的3个ACGT元件：WG1,WG2和WG3,其中WG1元件能强烈地竞争Hex元件与REB蛋白的结合,这提示水稻sbel基因与waxy基因在胚乳中的表达受到像REB这样的bZIP类转录因子的协同调控。     

胚乳特异sbeⅡa启动子在小麦中的评价及特性分析

淀粉的合成是一个复杂的生化过程. sbeⅡa基因是淀粉合成过程中的关键酶基因之一, 在小麦籽粒成熟过程中对淀粉, 尤其对支链淀粉的生物合成调控起重要作用. 为了解sbeⅡa基因的调控机理及其胚乳特异表达特性, 利用APCR方法克隆了sbeⅡa启动子3094 bp片段, 并对该片段进行测序, 同时利用GUS瞬间表达体系对sbeⅡa启动子序列进行不同片段的功能缺失研究. 研究结果表明, 3094 bp序列(存在于sbe.g融合体中)具有稳定的启动子活性, 而5′或3′缺失体的启动子活性明显降低. 在sbeⅡa启动子中间缺失体中, 一些缺失体仅有微弱活性, 但sbe.e在缺失–1579~–1210 bp片段情况下, 却具有比sbe.g(含启动子全长序列)还要高的启动子活性. 研究初步证明, 一些固定序列(motifs), 如 –300 bp因子、G盒以及醇溶蛋白盒(Prolamin box)等作为正调控因子在决定启动子胚乳特异表达模式中是必需的, 而且在–1579~–1210 bp片段中也存在一些负调控因子或固定序列. 在瞬间表达检测体系中, 小麦胚乳组织年龄对检测结果有着重要影响.     

玉米Cat1基因顺式元件ABRE2结合蛋白ABP9的基因克隆及功能分析

构建了授粉后17d(17dpp)的玉米幼胚cDNA基因文库，用玉米Catl基因顺式元件ABRE2通过酵母单杂交的方法筛选文库，获得3个完全相同的阳性克隆，命名为ABP9，用5′RACE的方法得到了该基因的全长cDNA序列，研究结果表明，ABP9属于bZIP类转录因子，与玉米Catl基因顺式元件ABRE2具有结合特异性，且在酵母细胞中具有转录激活功能。     

肝氨甲酰磷酸合成酶I基因转录起始位点的测定

氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)是尿素循环的第一个酶,主要存在于肝细胞线粒体中,是肝组织特异酶,与肝细胞的分化有关.我们曾观察到在大鼠肝癌诱发过程中,CPSI酶活性降低,实验证明癌变过程中CPSI基因表达的异常与基因转录调控可能有关.真核基因的转录的调控是通过反式作用因子(trsns-acting factor)与顺式作用元件(cis-acting element)的相互作用而实现的.顺式作用元件多存在于转录起始位点的5′端上游,对基因转录有调控作     

调控水稻异倍性杂交种子败育的相关基因分析

MADS29是控制水稻(Oryza sativa L.)种子饱满程度的基因,它通过调控母体组织细胞退化和维持体内激素平衡来影响种子发育.水稻异倍性杂交往往产生败育种子,为了探讨MADS29等种子发育相关基因是否参与其调控,本研究以4份水稻材料(2个二倍体;2个四倍体)构建4个自交组合(对照)和8个杂交组合(正反交),对花粉粒育性、花粉管萌发及伸长、种子发育及MADS29等相关基因表达进行分析.结果表明:(1)异倍性杂交均可正常受精,但杂交种子败育;(2)石蜡切片结果显示,授粉后3 d(3 day after pollination,3 DAP),与对照相比,4n×2n胚乳已进入细胞化时期,但细胞数量较少;而2n×4n胚乳处于合胞体时期,游离核周围未形成细胞壁,胚乳细胞化时期滞后;(3)实时荧光定量PCR(q RT-PCR)表明,6 DAP和8 DAP,MADS29、生长素基因和母体组织细胞程序化死亡(PCD)相关基因的相对表达量在杂交种子中均明显高于对照;淀粉合成基因在杂交种子中的相对表达量显著低于对照.本实验结果表明,在水稻异倍性杂交中,MADS29高表达,生长素基因和母体组织PCD相关基因表达上调,淀粉合成相关基因表达下调,导致胚乳发育异常、种子败育,说明MADS29的高表达导致异倍性杂交种子败育,是一种有别于二倍体水稻种子发育的新型调控方式.     

C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

利用安全性转基因技术导入反义蜡质基因降低稻米直链淀粉含量

利用安全性转基因技术中的共转化法, 将分别含有p13W₄双元载体(含有潮霉素抗性基因、gus报告基因以及反义蜡质基因片段)和p13W₈双元载体(无潮霉素抗性基因和gus报告基因, 只含有反义蜡质基因片段)的根癌农杆菌以1:9的比例混合导入超2-10高产水稻新品系中, 获得34棵转基因植株. PCR分析转基因T₀代植株, 结果显示, 有15株是共转化植株, 共转化率为44.1%. 利用p13W4双元载体上的gus报告基因从T₁代种子中淘汰具有报告基因及抗性标记基因的转基因后代, 再利用PCR检测从T₁代植株中获得只有反义蜡质基因的植株. Southern blot杂交分析证实, p13W₈双元载体T-DNA已整合进入无抗性标记及报告基因的转基因后代基因组中. T₂代成熟种子直链淀粉含量分析显示, 转基因植株糙米直链淀粉含量比对照有不同程度的下降, 幅度最大的比对照降低28.61%. 由于获得的转基因后代只有目的基因而无抗性选择标记基因和报告基因, 而且水稻中的稻米直链淀粉含量已降低, 它们既可被用于筛选软米材料, 也可视为是能够用于其他水稻稻米食味品质改良的水稻新资源.     

水稻过敏原基因cDNA原核表达产物的功能分析

在大多数的禾谷类植物中,如小麦、高梁、玉米等,广泛存在着抑制α淀粉酶的蛋白,它们属于禾谷类植物α淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂家族.长期以来人们认为在水稻中没有α淀粉酶抑制剂.近年来有人从水稻胚乳中分离到一类称为水稻过敏原(ＲｉｃｅＡｌｌｅｒｇｅｎ)的蛋白,分子量约14～16ｋｕ[1],由一个多基因家族编码[2].根据基因序列比较的结果人们把水稻过敏原归入α淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂家族,但对它们是抑制α淀粉酶还是抑制胰蛋白酶尚不清楚.我们通过ＲＴＰＣＲ从水稻未成熟种子中扩增并克隆了一个水稻过敏原基因ＲＡ17[3],并将其转到原核表达载…     

水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因（CCoAOMT）达特性分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的关键酶．从水稻(Oryza sativa L ssp japonica)中分离了CCoAOMT基因家族的3个成员OsCOA1，OsCOA20和OsCOA26．序列分析表明，OsCOA1基因由4个外显子和3个内含子组成，OsCOA20和OsCOA26则具有3个外显子和2个内含子．这3个基因与其他植物同类CCoAOMT氨基酸同源性较高，达75．43％，并具有CCoAOMT基因特有的保守序列元件．系统进化树分析表明，OsCOA1与玉米中CCoAOMT具有较近的亲源关系，OscOA20和OsCOA26则属于另一分支．Northern印迹和组织原位杂交结果显示，3个基因的mRNA在水稻的各组织均有积累，在幼叶的厚壁组织和维管束大量表达，说明该基因家族的3个成员与水稻的木质化进程关系密切．     

JUN和FOS基因增加水稻prolamin 4a基因的表达

水稻prolamin基因的表达具有发育(开花后种子成熟过程中)和组织(胚乳)的特异性,是研究基因表达调控的理想材料。目前,关于水稻prolamin cDNA和13,10kD prolamin的基因已经定序,而对其表达特异性在分子水平上的机理,尚未见报道. 周先锦、范云六报道了prolamin 4a基因启动子的序列并在转基因烟草植株中证实了该启动子的发育和组织特异性表达功能。该启动子属于13kD prolamin基因启动子,具有与     

水稻mRNA多聚腺苷化信号位点的序列分析

大部分真核生物mRNA的加工涉及到mRNA前体的分裂/多聚腺苷化, 在3′-末端形成多聚腺苷酸(poly(A))尾巴. 为了研究水稻mRNA前体多聚腺苷化过程所必需的poly(A)加尾信号、下游调控元件和poly(A)位点等序列的特点, 用3′-末端带有poly(A) 的EST与全长cDNA序列进行比较, 建立了一个来自9953个基因的、覆盖12969条poly(A)位点两侧各40碱基序列的数据库. 结果发现, 只有7.9%的mRNA使用AAUAAA作为加尾信号, 超过60%使用AAUAAA的1~2个碱基变化的序列作为加尾信号, 11.5%的mRNA使用AAUGAA及其单碱基变化的加尾信号. 在约25%的mRNA的3′-末端存在多个poly(A)位点. 在90%的mRNA前体的加尾信号下游都能检测到富含U/GU的调控元件, 尤其在以AAUAAA的多碱基变化序列作为加尾信号的mRNA前体中, 半数以上都能在poly(A)位点两侧检测到下游调控元件. 而且, 这些调控元件的位置对poly(A)位点的选择有限制作用. 总之, 虽然水稻mRNA加尾信号的保守性较低, 但大量下游调控元件的存在保证了多聚腺苷化过程的正常进行.     

携带主效落粒基因的水稻染色体片段代换系Z481的鉴定及和SH6(t)定位

落粒性是水稻非常重要的农艺性状,适度落粒有利于减少产量损失和水稻机械化收割,提高生产效率.因此鉴定落粒基因对水稻生产具有重要意义.本研究以日本晴为受体亲本、优良恢复系R225为供体亲本,采用高代回交和SSR标记辅助选择相结合的方法,鉴定了一个携带易落粒主效单基因的水稻染色体片段代换系Z481.Z481含有4个染色体代换片段,位于第1,3,6染色体上,其代换片段长度分别为8.30,6.17,3.12和10.79 Mb,平均为7.10 Mb.与受体日本晴相比,Z481的株高、穗长、倒一节间长、倒二叶宽显著降低,剑叶宽和结实率显著增加,其他重要农艺性状如叶长、有效穗数、每穗粒数和千粒重均无显著差异.扫描电子显微镜观察表明Z481的护颖和枝梗之间的离层在成熟时期已被完全降解,而日本晴的离层完整,在细胞学上解释了Z481易落粒性产生的原因.进一步利用日本晴与Z481杂交产生的F_1和F_2群体对易落粒基因进行了遗传分析和分子定位.该易落粒性状受单基因隐性调控,最终将该基因定位于第6染色体RM253和ZTQ53之间824 kb的区域,暂命名为SH6(t).目前,在第6染色体尚无落粒基因克隆的报道.由于染色体片段代换系除代换片段外与受体亲本的遗传背景一致,且Z481易落粒遗传行为简单,基本未携带育种不利性状.因此,本研究无论对SH6(t)的克隆,还是进行基因聚合育种培育适度落粒新品种均具有重大利用价值.     

一个水稻P450 CYP72A基因簇受病原菌诱导和发育及组织特异性表达

细胞色素P450超基因家族广泛参与植物的各类生命活动,包括植物对病原菌的防卫反应.我们在植物病原菌诱导基因的DD-PCR分析时,分离到一个受病原菌侵染诱导的水稻cDNA片段.水稻基因组公布后,发现该片段位于1个包含7个P450 CYP72A基因(CYP72A17～23)的基因簇的保守部分.以此片段搜索水稻数据库发现,水稻CYP72A家族有14个成员,这14个蛋白质之间的差异主要在N端,C端则同源性很高.我们分别对该基因簇的7个成员进行了表达特性分析,发现其中CYP72A18,19,22和23的表达受稻瘟病菌侵染的调节,而且在抗、感植株中的表达存在明显差异.除CYP72A20外,其余6个CYP72A基因均具有发育和组织特异性表达的特征.CYP72A20在所有研究中均检测不到信号,可能为一个假基因.这些发现为水稻P450基因功能的研究提供了新的资料.     

水稻茸毛基因GL6的遗传学分析与精细定位

叶片表面茸毛是水稻形态学特征上的一个重要农艺性状,对水稻的生长及生理特性有着重要的影响.应用叶片具有茸毛特征的水稻品种75-1-127,无茸毛水稻品种明恢63,光身稻品种Lemont,9311分别杂交产生F1及F1自交产生的F2群体对水稻茸毛基因进行遗传学分析,结果表明,水稻茸毛性状为一对细胞核基因控制的显性性状.应用75-1-127/明恢63的F2隐性分离群体,结合分离群体分析法(BSA)和隐性群体分析法(RCA),并通过Mapmaker3.0/MapDraw软件分析,将水稻茸毛基因GL6初步定位在水稻第6号染色体上,位于SSR标记RM20491和RM20547之间,且两标记与该茸毛基因的相对遗传距离分别为7.2和2.2cM.进一步构建大的F2分离群体并同时挖掘新的SSR标记及插入缺失InDel标记用于茸毛基因GL6的精细定位,将茸毛基因GL6精细定位在插入缺失标记InDel-106和InDel-115之间,且两标记与该茸毛基因的相对遗传距离分别为0.3和0.1cM,结合GeneBank数据库分析,在该精细定位区域内,对应粳稻日本晴和籼稻9311的物理距离分别为79和116.82kb,分别注释有7个和8个预测基因,为进一步的基因克隆和功能研究奠定了基础.     

水稻淀粉合成相关基因分子标记的建立

稻米品质改良是水稻育种的重要方面, 传统的常规育种方法由于缺乏对目标基因有效检测的手段, 无法对稻米品质的基因型进行有效操作, 因而品质改良进展缓慢. 利用分子标记辅助选择与传统育种技术相结合, 可以在对稻米外观品质进行鉴定的同时, 对被选个体的基因型进行准确的鉴定. 结合品质的测定, 可以大大提高育种效率. 但是, 目前可用于稻米品质分子辅助育种的分子标记很少. 稻米品质与淀粉组分密切相关, 我们分析了16个典型水稻品种18个在淀粉合成中的重要基因的全基因序列, 明确了各个基因在不同种质中的等位变异, 设计了51个可以区分不同等位基因变异的分子标记, 这可为稻米品质的分子育种提供可靠的依据.     

水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(CCoAOMT)表达特性分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的关键酶. 从水稻(Oryza sativa L ssp japonica)中分离了CCoAOMT基因家族的3个成员OsCOA1, OsCOA20和OsCOA26. 序列分析表明, OsCOA1基因由4个外显子和3个内含子组成, OsCOA20和OsCOA26则具有3个外显子和2个内含子. 这3个基因与其他植物同类CCoAOMT氨基酸同源性较高, 达75.43%, 并具有CCoAOMT基因特有的保守序列元件. 系统进化树分析表明, OsCOA1与玉米中CCoAOMT具有较近的亲源关系, OsCOA20和OsCOA26则属于另一分支. Northern印迹和组织原位杂交结果显示, 3个基因的mRNA在水稻的各组织均有积累, 在幼叶的厚壁组织和维管束大量表达, 说明该基因家族的3个成员与水稻的木质化进程关系密切.     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(1arval serum protein,Bombyx mori,BmLSP)的调控序列,涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区.通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法,以荧光素酶(luc)为报告基因,构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒,在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析.结果表明,含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍,暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件.上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用.此外,外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应,低浓度处理增强启动子活性,高浓度处理起抑制作用;而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

水稻包穗突变体esp2 的遗传分析与基因精细定位

水稻的包穗现象主要是由倒一节间缩短造成的. 阐明包穗形成的分子机制, 对解决水稻不育系的包穗问题, 创造水稻新种质具有重要意义. 我们在籼稻品种明恢86 的组织培养后代中获得了1 个包穗突变体, 命名为esp2(enclosed shorter panicle 2), 其穗部被剑叶叶鞘完全包裹, 倒一节间几乎完全退化, 而其余各节间长度则没有明显改变. 遗传分析表明, esp2 受一对隐性基因控制, 能稳定遗传且不受遗传背景的影响. 显然, ESP2 是控制水稻倒一节间发育的一个关键基因. 利用esp2 与粳稻品种秀水13 杂交的F₂ 群体以及SSR 和InDel 标记, 将ESP2 精细定位在1 号染色体短臂末端一个14 kb 的区域内. 根据水稻基因组序列的注释, 该区域内只存在1 个完整的基因, 亦即一个假定的磷脂酰丝氨酸合成酶(putative phosphatidylserine synthase)基因. 对野生型和突变体的测序分析结果表明, 该基因内部插入了一个5287 bp 的反转座子序列. 因此, 我们将该基因作为ESP2 的候选基因. 本研究结果为ESP2 基因的克隆和功能分析奠定了基础.     

抗CD20嵌合Fab′片段对B淋巴瘤细胞的生长抑制作用

利用PCR方法从抗CD20ScFv表达载体上扩增重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因,然后将VH,VL基因重组到Fab′表达载体中,构建成抗CD20嵌合抗体Fab′片段表达载体pYZFcd20.用pYZFcd20转化大肠杆菌16C9,在16C9菌中分泌表达可溶性抗CD20Fab′片段,经分离纯化获得具有CD20抗原特异结合活性的嵌合抗CD20抗体Fab′片段.竞争性免疫荧光抑制实验表明,抗CD20Fab′片段能竞争性抑制亲本鼠源性抗CD20单克隆抗体HI47和Daudi细胞CD20结合.MTT法测定结果显示,抗CD20Fab′对Daudi细胞生长具有抑制作用.