尖吻蝮蛇凝血酶分离纯化新工艺研究

尖吻蝮蛇凝血酶是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化得到的一种类凝血酶,属于止血一类新药。建立了尖吻蝮蛇凝血酶分离纯化新工艺,采用切向流过滤技术,用两步离子交换层析分离得到高纯度的尖吻蝮蛇凝血酶,再采用两步凝胶排阻层析去除热原和脱盐。该工艺具有简便高效的特点,适合大规模工业化生产。     

小叶三点金醇提物对尖吻蝮蛇毒的抑制作用

研究小叶三点金Desmodium microphyllum醇提物对尖吻蝮蛇Deinagkistrodon acutus蛇毒的抑制作用。将尖吻蝮蛇毒与不同比例小叶三点金醇提物在37℃下孵育30 min,检测对蛇毒中主要酶活力以及体内毒性的抑制作用。小叶三点金醇提物对尖吻蝮蛇毒中蛋白水解酶、磷脂酶A2、透明质酸酶以及纤维蛋白原水解酶均具有明显的抑制作用,对尖吻蝮蛇毒引起的小鼠出血、水肿、组织坏死以及致死毒性具有显著的中和作用,且呈剂量效应关系。首次证实了小叶三点金具有抑制尖吻蝮蛇毒的功效,为小叶三点金在蛇伤治疗中的应用提供了理论依据。     

小叶三点金不同萃取相对尖吻蝮蛇毒主要酶类的抑制作用

【目的】考察小叶三点金(Desmodium microphyllum)乙醇提取物不同萃取相对尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)毒主要酶类的抑制作用。【方法】采用不同极性溶剂对小叶三点金乙醇提取物进行萃取,检测各萃取相对尖吻蝮蛇毒中蛋白水解酶、磷脂酶A2、透明质酸酶和类凝血酶的抑制作用,再结合气相色谱-质谱法(GC-MS)对抑制作用最强的萃取相进行组分分析。【结果】乙酸乙酯萃取相能够明显抑制尖吻蝮蛇毒中的蛋白水解酶、磷脂酶A2和透明质酸酶和类凝血酶的活性,经GC-MS分析检测出26种成分,其中正十六烷酸、十八碳烯酸、豆甾醇和谷甾醇具有抑制蛇毒活性的作用。【结论】小叶三点金醇提物乙酸乙酯萃取相对尖吻蝮蛇毒中主要酶类具有明显抑制作用,能够作为有效部位用于抗蛇毒功效组分的筛选研究。
     

黑老虎醇提物对尖吻蝮蛇毒主要酶类的抑制作用

【目的】探究中草药黑老虎(Kadsura coccinea)醇提物对尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒中主要酶类的抑制作用。【方法】用体积分数为75%的乙醇溶液浸泡黑老虎后再进行超声波处理得到醇提物；通过体外酶活抑制实验分别检测醇提物对尖吻蝮蛇毒中磷脂酶A2、蛋白水解酶、透明质酸酶、类凝血酶的抑制作用。【结果】黑老虎醇提物对尖吻蝮蛇毒中的蛋白水解酶、磷脂酶A2和透明质酸酶具有明显的抑制作用。当蛇毒与醇提物的质量比分别为1∶100，1∶10和 1∶5时，后者能抑制蛇毒中98%磷脂酶A2活性、79%蛋白水解酶活性和65.14%透明质酸酶活性。同时，醇提物能够明显抑制尖吻蝮蛇毒水解纤维蛋白原和类凝血酶的活性。【结论】研究结果证实了黑老虎醇提物能有效抑制尖吻蝮蛇毒中的主要酶类，为深入研究黑老虎药材的抗蛇毒机制提供了理论依据。     

尖吻蝮蛇毒对人卵巢癌A278O细胞的抑制作用研究

【目的】研究尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒对人卵巢癌A2780细胞(后简称A2780细胞)形态学特征、细胞增殖活力及粘附能力的影响。【方法】采用倒置荧光显微镜观察在不同质量浓度和时间条件下,尖吻蝮蛇毒对A2780细胞形态学特征的影响;采用CCK-8法检测细胞增殖率的变化,使用细胞计数法检测尖吻蝮蛇毒对细胞粘附能力的影响。【结果】当尖吻蝮蛇毒质量浓度为3.125μg·mL-1时,A2780细胞出现少量皱缩、变圆、凋亡的现象;随着尖吻蝮蛇毒质量浓度增加,细胞凋亡的现象愈加明显。当用50μg·mL-1的尖吻蝮蛇毒处理A2780细胞1h后,被处理细胞出现少量皱缩、变圆现象;12h后,被处理细胞粘连成团,出现大量凋亡现象。在3.125～200μg·mL-1范围内,随着尖吻蝮蛇毒质量浓度的增加,A2780细胞增殖活力逐渐减弱,且呈明显剂量依赖关系。当用3.125μg·mL-1的尖吻蝮蛇毒处理A2780细胞时,细胞粘附率降为78.26%;当蛇毒质量浓度为25μg·mL-1时,细胞粘附率降为不足10%。【结论】尖吻蝮蛇毒可明显影响A2780细胞的形态学特征,抑制该细胞的增殖活力以及粘附能力。     

大肠杆菌中重组尖吻蝮蛇类凝血酶的纯化及鉴定

尖吻蝮蛇类凝血酶直接裂解纤维蛋白原且不激活凝血因子表现出良好抗凝效应,是重要的血栓类药物。大肠杆菌中高效表达重组尖吻蝮蛇类凝血酶,通过阴离子层析(DEAE650M,0.02M PBS+0.2M Na Cl洗脱)和亲和层析(镍柱,0.02M PBS+0.5M Na Cl溶液+20m M咪唑溶液洗脱),获得较纯样品。利用肠激酶酶切、纤维蛋白凝结活性、免疫印迹方式鉴定纯化样品为活性目的蛋白。此结果为商品化生产、应用类凝血酶提供思路及方向。     

尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化

将尖吻蝮蛇类凝血酶基因克隆到载体pET32a(+)上,在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达N端融合了硫氧还原蛋白的类凝血酶.通过SDS-PAGE检测融合蛋白条带,纤维蛋白原凝结实验检测酶学活性.确定表达菌株后,对其诱导条件进行优化,在30℃诱导3 h,诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol·L-1条件下类凝血酶表达水平最高.     

石柑子水提物对尖吻蝮蛇毒活性抑制作用的初步研究

【目的】寻找用于治疗尖吻蝮(Agkistrodon acutus)咬伤的中草药石柑子(Pothos chinensis)的药效实验证据。【方法】将制备所得石柑子水提物与尖吻蝮蛇毒混合孵育40min,检测混合液中蛇毒的磷脂酶 A2 活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、出血活性、凝血活性和致死活性。【结果】石柑子水提物对尖吻蝮蛇毒的磷脂酶 A2 活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、出血活性、凝血活性和致死活性都有明显抑制作用。【结论】研究结果初步证实了石柑子对尖吻蝮咬伤具有治疗效果。
     

石柑子水提物对尖吻蝮蛇毒活性抑制作用的初步研究

【目的】寻找用于治疗尖吻蝮(Agkistrodon acutus)咬伤的中草药石柑子(Pothos chinensis)的药效实验证据。【方法】将制备所得石柑子水提物与尖吻蝮蛇毒混合孵育40min,检测混合液中蛇毒的磷脂酶A2活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、出血活性、凝血活性和致死活性。【结果】石柑子水提物对尖吻蝮蛇毒的磷脂酶A2活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、出血活性、凝血活性和致死活性都有明显抑制作用。【结论】研究结果初步证实了石柑子对尖吻蝮咬伤具有治疗效果。     

~(125)I-碘化钠标记尖吻蝮蛇毒NAD糖甘水解酶在小鼠体内的分布

以氯胺T为氧化剂制备了~(125)Ⅰ一标记尖吻蝮蛇毒NAD糖苷水解酶,将~(125)Ⅰ—NAD糖苷水解酶注入小鼠尾静脉,观察小鼠体内各脏器及血液中不同时间的分布情况,发现~(125)Ⅰ—NAD 糖苷水解酶住血液和大多数组织中放射活性在3小时内较高,3小时后下降较快,12小时后稳定,48小时随尿、粪便排泄完.以3小时测量各组织放射性脉冲数/分钟相加合计算(相对百分数),血液27.8%>胃20.8%>肾16.6%>肺12.2%>脾7.0%>肝5.2%>小肠4.9%>心4.6%>脑0.8%.     

蛇莓乙醇提取物抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性初探

【目的】初步探究蛇莓(Duchesnea indica)对尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒蛋白水解酶的抑制作用。【方法】采用不同极性有机溶剂对蛇莓乙醇提取物进行分级萃取,结合硅胶薄层层析(TLC)进行分离,再利用气相色谱-质谱法(GCMS)对抑制蛋白水解酶作用最强的活性部位进行组分分析。【结果】乙酸乙酯萃取相具有较强的抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性;经硅胶TLC分离从中获得条带1、条带2、条带3和条带4共4个条带,且条带4的尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶抑制活性最强。通过GC-MS分析检测出条带4中存在15种成分,其中2,4-二叔丁基苯酚、正十六烷酸、十八烷酸、十六烷酸,2-羟基-1-(羟甲基)乙酯、硬脂酸-2-羟基-1-(羟甲基)乙酯和10,13-十八碳二炔酸甲酯可能与抑制蛇毒活性相关。【结论】蛇莓中存在抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶的功效组分,可以作为蛇伤药物开发的资源。     

低共熔溶剂对丹酚酸B药物组织分布的影响

为了研究低共熔溶剂对丹酚酸B在小鼠体内的药物组织分布影响,将健康小鼠随机分为对照组和受试组,其中对照组和受试组分别给予溶解在水中的丹酚酸B和溶解在氯化胆碱-甘油(摩尔比1∶2)中的丹酚酸B,小鼠按200mg/kg灌胃给予丹酚酸B后收集不同时间点的心、脑、肝组织器官,并采用HPLC-MS法测定给药后组织中的丹酚酸B含量。结果表明,受试组中丹酚酸B在肝组织的达峰时间为20min,较对照组相比提前了10min;且达峰浓度为1.66μg/g,约为对照组峰浓度的1.63倍。由此可见,低共熔溶剂可以增加丹酚酸B在小鼠肝组织中的分布,并且加快其吸收和消除,起到一定的减毒增效作用。     

抗尖吻蝮蛇毒卵黄抗体口服给药保护剂的研究

【目的】比较硫糖铝和5种糖类对抗尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)毒卵黄抗体(IgY)的保护作用,为开发抗尖吻蝮蛇毒IgY口服制剂提供依据。【方法】通过免疫白来航鸡(Gallus domesticus),从所产鸡蛋中制备抗尖吻蝮蛇毒IgY。在不同pH值(2.0,3.0)条件下,于IgY中加入相同剂量的保护剂,用ELISA法测定IgY活性;在pH值为2.0且加入条件下,加入等于或高于胃内正常质量浓度的胃蛋白酶,后加入不同剂量的硫糖铝,再用ELISA法测定IgY抗体活性;用不同剂量的保护剂与IgY混合后灌胃小鼠(Mus musculus),在不同时间点(1.5,2.5,3.5h)取血,采用ELISA和Western法测定血清中的IgY活性。【结果】在pH值为2.0和3.0条件下,硫糖铝对IgY抗体活性的保护效果均为最佳;在pH值为2.0且加入不小于胃内正常的胃蛋白酶质量浓度的条件下,体积分数在30%以上的硫糖铝均可提高IgY活性;IgY灌胃后的小鼠血清中,体积分数为50%的硫糖铝可有效保护IgY活性。【结论】加入硫糖铝作保护剂后能有效提高IgY对胃酸和胃蛋白酶的抵御作用。     

抗尖吻蝮蛇毒卵黄抗体口服给药保护剂的研究

【目的】比较硫糖铝和5种糖类对抗尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)毒卵黄抗体(IgY)的保护作用,为开发抗尖吻蝮蛇毒IgY口服制剂提供依据。【方法】通过免疫白来航鸡(Gallus domesticus),从所产鸡蛋中制备抗尖吻蝮蛇毒IgY。在不同pH 值(2.0,3.0)条件下,于IgY中加入相同剂量的保护剂,用ELISA 法测定IgY 活性;在pH 值为2.0且加入条件下,加入等于或高于胃内正常质量浓度的胃蛋白酶,后加入不同剂量的硫糖铝,再用ELISA法测定IgY 抗体活性;用不同剂量的保护剂与IgY混合后灌胃小鼠(Mus musculus),在不同时间点(1.5,2.5,3.5h)取血,采用ELISA和Western法测定血清中的IgY活性。【结果】在pH 值为2.0和3.0条件下,硫糖铝对IgY抗体活性的保护效果均为最佳;在pH 值为2.0且加入不小于胃内正常的胃蛋白酶质量浓度的条件下,体积分数在30%以上的硫糖铝均可提高IgY 活性;IgY 灌胃后的小鼠血清中,体积分数为50%的硫糖铝可有效保护IgY 活性。【结论】加入硫糖铝作保护剂后能有效提高IgY 对胃酸和胃蛋白酶的抵御作用。
     

尖吻蝮蛇毒不同蛋白酶水解物的制备及抗氧化活性研究

【目的】研究尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒的不同蛋白酶水解产物的制备及抗氧化活性。【方法】分别用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解尖吻蝮蛇毒,以水解物的水解度、清除自由基活性、金属离子螯合能力和总还原力作为抗氧化活性比较指标来选出最佳水解蛋白酶,并比较该蛋白酶水解物在超滤后得到的不同分子量组分的抗氧化活性大小。【结果】碱性蛋白酶水解物的清除DPPH自由基活性、亚铁离子螯合能力和总还原力均为最佳;该酶解物经超滤得到的3个组分中,分子量为3～10kDa的组分对DPPH自由基和羟基自由基清除能力最强,分子量大于10kDa的组分的亚铁离子螯合能力和总还原力最强。【结论】尖吻蝮蛇毒的不同蛋白酶水解物均具有抗氧化活性,其中用碱性蛋白酶水解物抗氧化活性较强。     

3H-二脱水伊地醇双甲磺酸酯在小鼠体内的吸收、分布和排泄

采用＾３Ｈ－标记药物和放射性测定法，测定了抗肿瘤药二脱水伊地醇双甲磺酸酯在小鼠体内的吸收，分布和排泄，并进行了药动学参数统计学处理，结果表明，ＤＭＤＡＩ静注时血度浓度分布快，但消除较慢，灌胃给药时吸收迅速。静注和灌胃时组织中分布均以胆汁及肝脏含量较高，静注７ｄ内药物在粪尿中排泄完全，不易蓄积。     

土霉素残留在鲫鱼体内的消除规律

在(10±1)℃水温条件下,用50mg/kg剂量对鲫鱼口灌土霉素3d,每天2次.用紫外分光光度计测定鲫鱼 血液和组织中土霉素的残留量.结果表明:在土霉素消除期间,肾脏中土霉素残留量最高,肌肉中最低,血液和肌 肉中土霉素的含量与时间的动态变化趋势很相似;给药后的第32h,土霉素的量在血液和组织中达到最高含量;土 霉素在达到最高含量之后的一段时间内,肾脏中土霉素含量随着时间的推移急剧下降,而在肌肉中,土霉素含量随 着时间的推移缓慢下降;第288h时,土霉素在肝脏、肌肉和血液中已经下降到较低水平,其含量分别为0.53, 0.12,0.39mg/kg,肾脏中药物含量仍然很高,为2.75mg/kg.由此得知:在所有的组织中,肌内中土霉素的残留 量是最低的;最后一次给药后的第12d后,人食用鱼肉是安全的.     

甲基苯丙胺在成瘾与戒断大鼠体内分布比较

目的 比较甲基苯丙胺在成瘾与戒断后给药致死大鼠体内的分布情况.方法 建立动物模型获得所需检材,经酸化水解后用环己烷提取,利用GC-MS全扫描定性分析,选择离子扫描定量分析.结果 甲基苯丙胺在成瘾组脾、肺、眼中的含量明显低于戒断组;成瘾组心、肝、肾、脑、肌肉、睾丸中含量略高于戒断组;成瘾组肝中含量最高,戒断组脾中含量最高...     

磺胺二甲基嘧啶在海兰鸡组织中的浓度测定

为进一证实磺胺二甲基嘧啶（以下简称ＳＭ２）防治鸡球虫病的实用价值，测定了该药给药后不同时间在海兰鸡心、肺、肝、肾、脾、肌肉和小肠等组织中的浓度．发现ＳＭ２在海兰鸡体内吸收快，分布广泛，在心、肝、肺、肾及小肠中浓度较高，尤其在小肠内浓度最高，给药后０．５ｈ药物浓度高达２７．８０３４（ｍｇ／１００ｍｌ），给药后６ｈ内药物浓度均值为１１．４９６８（ｍｇ／１００ｍｌ），都大大超过了磺胺药在血液中的最低有效浓度（５ｍｇ／１００ｍｌ），进一步证实了ＳＭ２防治鸡球虫病的实用价值．     

~(125)I标记尖吻蝮蛇的一种出血毒素在兔体内的药代动力学研究

尖吻蝮蛇(五步蛇)的蛇毒属血循环毒,是蛇咬伤中死亡率最高的。致死的主要原因是全身性出血及局部组织坏死,目前尚无有效的临床治疗方法。因此,对出血毒的研究,不论对探讨其出血致死的机理还是对寻找有效的治疗方法均是十分重要的。我们用标记示踪的方法,研究其在兔体内的分布,用微机拟合血药浓度——时间曲线,计算其模型参数,研究其代谢动力学性质。