紫云英根瘤菌nodD基因的克隆及核苷酸序列

豆科植物紫云英(Astragalus sinicus)是生长于我国南方地区的重要绿肥之一.紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii即R.astragali)是革蓝氏阴性细菌,感染豆科植物紫云英后形成有效的固氮根瘤.决定根瘤菌在宿主植物引起根瘤的基因称结瘤基因(nod和nol基因),nod和nol基因的诱变将导致根瘤菌不能或延迟在宿主植物上结瘤.这些基因包括共同结瘤基因nodABC,nodIJ.宿主专一性结瘤基因(hsn)nodEF,nodG,nodH,nodQ等及与结瘤有关的一些nol基     

苜蓿根瘤菌nod C蛋白生化特性的分析

根瘤菌的共同结瘤基因nod A,B和C,具有高度的保守性。这些基因对诱发宿主根毛的卷曲和根瘤早期的形成起重要作用.比较苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)和碗豆根瘤菌(R. Leguminosarum)结瘤基因的DNA序列,由此得出nod C蛋白(Nod C)的氨基酸顺序同源性达95％。最近开始对结瘤蛋白生化功能的研究表明,Nod C的结构同细胞表面受体非常类似。     

固氮正调节基因nifA促进大豆根瘤菌的结瘤效率

先前的工作指出nifA不仅调节niffix基因的表达，同时可能也调节包括根瘤形成和维持根瘤功能中的一些基因，通过在大豆根瘤菌Sinorhizobium fredii NH01中引入额外组成型表达的肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）nifA，研究固氮正调节基因nifA对共生结瘤过程的影响，研究结果发现，引入KpnifA可提高大豆根瘤菌的结瘤活力及竞争结瘤能力，同时初步试验结果证实，带额外nifA的大根瘤菌比野生型大豆根瘤菌具有更高的结瘤因子活性，推测nifA对结瘤过程的促进作用可能作用于根瘤菌的结瘤因子合成阶段，由于结瘤因子是诱导主形成根瘤的主要信号分子，而结瘤过程具有自我调节作用，植株一旦结瘤，就会抑进一步结瘤，因此引入固氮正调节基因nifA能提高结瘤效率。     

紫云英根瘤菌nif DNA的分子克隆

固氮微生物中涉及到与固氮作用有关的基因的研究已有详细的报道. 共生固氮根瘤菌中参与固氮作用的基因有二类,一类是与肺炎克氏杆菌Kp nif基因有同源性的基因——nif基因,另一类是在共生状态进行固氮作用所必需的其它基因——fix基因.根瘤菌中nif与fix基因中的任何一个基因发生突变,根瘤菌虽仍感染宿主发育成根瘤,但不能固氮.     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) nifA基因通过诱导宿主防卫反应调节根瘤的形成

苜蓿中华根瘤菌nifA基因是固氮基因的正调节因子, 本文研究了nifA基因对根瘤形成的调节作用. 在分裂根实验中, nifA突变株对另一侧根的结瘤抑制率比野生型菌下降43.7%, 感染突变株植物合成的植保素和形成的坏死细胞的数量也相应减少, 与植物防卫反应相关的苯丙氨酸解氨酶基因、查儿酮合成酶基因和几丁质酶基因不能表达. 这些结果说明, 苜蓿中华根瘤菌nifA基因通过诱导宿主植物的防卫反应对根瘤的形成进行调节. 虽然nifA突变株在宿主植物上引发根瘤的数量增加, 它合成的结瘤因子的量却比野生型菌株少. 因此, 可以推测nifA基因介导了多种信号途径对根瘤的形成进行调节.     

nifA突变的苜蓿根瘤菌在根瘤中的转录组学分析

用全基因组微阵列比较了根瘤中苜蓿根瘤菌1021的nifA突变菌和野生菌的基因表达谱. 分析结果表明, nifA的缺失引起601个基因的表达发生变化. 这些基因分别属于生物大分子的合成代谢、三羧酸循环及呼吸代谢以及结瘤固氮过程等多个功能组, 预示着根瘤中细菌的生长状态发生了显著的变化. 在根瘤中, fixK以及受其激活的基因在nifA突变菌中的表达量显著高于野生菌. 定量实时PCR分析表明, 根瘤中fixLJ的转录水平在nifA突变菌中显著高于野生菌. 通过统计学方法从13个表达发生显著变化的基因的上游调控序列中找到推测的NifA结合位点.     

结瘤基因群调控蛋白Nod D在DNA分子上的结合位点的测定

豆科植物和根瘤菌协同进行共生固氮,是自然界将游离的N_2转化成有机NH_3的主要途径之一。共生固氮只有在根瘤内环境中才能进行。通过转座突变、重组克隆和转化等一系列实验后发现,共生固氮菌中存在着一群特定的基因——结瘤nod基因,它们引起植物根部结瘤,并决定寄主的专一性。不同根瘤菌内的nod基因数量虽然不同,但一般不超过十多个。     

关于诱导无根瘤植物结根瘤的研究——化学因子2,4-D诱导根瘤菌在小麦上结根瘤

本文发现在灭菌的无氮培养液中,无菌培养通过或不通过春化阶段的无菌小麦幼苗,接种大豆根瘤菌,加入终浓度为1ppm的灭菌的2,4-D,于25～30℃下,在阳光照射的无菌箱内,用500ml的三角瓶培养,结果大豆根瘤菌能侵入小麦幼根结根瘤。在小麦根瘤的石蜡切片上和由瘤内分离出的菌体涂片上进行的荧光抗体试验和用接种的根瘤菌的抗血清与由瘤内分离的菌进行的玻片凝集反应及大豆根瘤菌鉴别的微生物学方法,都证明瘤内的菌为接种的大豆根瘤菌。试验组结瘤小麦的长势比对照组好,经低温处理者能抽穗、开花、结籽;而各对照组则在苗期枯萎。上述试验多年来以不同方法重复十多次以上,每次都能结根瘤。但固氮的问题尚需取得小麦整株干重的统计学数据和进行~(15)N_2示踪,进一步进行研究、确定。     

苜蓿中华根瘤菌烯脂酰ACP还原酶基因fabI1的功能研究

我们先前的工作表明, 苜蓿中华根瘤菌的烯脂酰ACP还原酶基因fabI1在nifA突变根瘤中表达水平降低. 本研究构建了fabI1的定点插入突变体. 与野生型相比, 突变菌株的生长速度变慢, 在高浓度NaCl培养基上的生长能力降低. 在半固体培养基上, 该突变体的涌动能力完全丧失. 在共生过程中, 突变菌株在宿主植物上延迟结瘤, 形成根瘤的能力下降. 虽然苜蓿中华根瘤菌中的烯脂酰ACP还原酶基因fabI2的序列与fabI1有66%的一致性, 但fabI2不能恢复fabI1突变体的表型, 揭示了这两个基因在功能上的差异.     

华南酸性低磷土壤中大豆根瘤菌高效株系的发现及应用

在大豆栽培历史不同的酸性缺磷土壤上, 从磷效率不同的两个大豆品系的根瘤中分离纯化出12株根瘤菌菌株. 16S rDNA测序分析结果表明, 分离纯化出的12株根瘤菌菌株为慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)属的慢生根瘤菌菌株, 与对照大豆慢生型根瘤菌(Bradyrhizboium japonicum) USDA110菌株相比, 具有较高的固氮酶活性. 选取其中固氮酶活性最高的3株根瘤菌株系混合制成的根瘤菌菌剂, 在华南地区典型的酸性缺磷土壤上进行田间实验, 结果表明, 不接种根瘤菌, 3个供试大豆品系完全不能结瘤; 接种根瘤菌后, 供试大豆品系的结瘤率为100%, 不仅能形成较多根瘤, 而且能显著提高大豆地上部生物量和产量, 改善植株氮、磷营养状况. 其中, 大豆品种华春3号的地上部干重、氮和磷含量分别比不接种提高了154.3%, 152.4%和163.2%. 研究结果表明, 本研究在华南酸性缺磷土壤中发现了土著的高效根瘤菌株系, 这些株系具有宿主范围广、高效结瘤、固氮效率高和耐酸、耐低磷的特点, 对华南地区酸性缺磷土壤具有较好的适应性; 土壤环境、宿主类型是筛选高效根瘤菌株系需考虑的关键因素, 综合选择不同酸度范围土壤、不同磷效率大豆品种可提高获得高效根瘤菌株系的几率; 增加氮营养、促进根系生长是酸性缺磷土壤上接种高效根瘤菌增加大豆磷吸收的可能机理; 在酸性缺磷土壤上接种高效根瘤菌, 能显著促进大豆生长、改善大豆氮、磷营养状况, 是提高该地区大豆种植水平、发展大豆生产的有效途径. 因此, 在实际生产中大力推广豆科作物接种高效根瘤菌技术具有重要的经济、环境和生态效益.     

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中, 根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子. 结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化. 水稻是重要的粮食作物, 能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素. 将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因b-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2BP-GUS, 以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记. 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统, 获得了携带嵌合基因Gmenod2BP-GUS的水稻再生植株. 以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针, 检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2BP-GUS的表达. 结果表明, 转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导, 仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达, 并且受到氮源的调控. 推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.     

大豆结瘤和固氮的现代遗传学与生物技术学

大豆(Glycine max)是一种重要的供给粮食和动物饲料的主要农作物。作为豆科植物的一员,大豆与一种被称之为根瘤菌的土壤细菌形成了复杂的共生关系,结果导致新的根器官--根瘤的形成。在这个吸引人的新器官中,被植物所囚禁的根瘤菌能把空气中的氮气转换为可利用的氮肥。在巴西,有助于增加种子收成的细菌菌株借助微生物学手段已经被分离出来。目前,现代遗传学、生物技术学、生理学、生物化学和基因组学使得分离根瘤形成过程中的关键基因成为现实。 综合这些研究发现了诱导,并随后控制细胞分裂的一种新的分子机制。笔者所在的研究小组已经在大豆中克隆到了根瘤菌结瘤因子信号的关键受体,以及一些在复杂的根-茎-根信号传递途径中的分子组分,这些组分涉及到肽类激素,受体激酶和小的信号代谢产物。上述发现表明提高大豆产量和抗逆性的大豆改良进入一个新的阶段。     

紫云英参与共生固氮的2个新结瘤素基因的分离与鉴定

通过抑制差减杂交, 比较了接种华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) 7653R的紫云英(Astragalus sinicus)的根与未接种根瘤菌的对照根在转录水平上的差异, 建立了紫云英共生结瘤过程中的差异表达基因文库, 并在此基础上证实了2个结瘤特异性基因AsⅡC259和AsG2511. 其可读框显示, AsⅡC259和AsG2511编码的多肽链长度分别为134和58个氨基酸, 其氨基端均含有一个信号肽. 结构域查询结果揭示, AsⅡC259编码的多肽链包含了2个N-糖基化位点、一个依赖于cAMP的蛋白激酶(PKA)和cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)磷酸化位点以及一个酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点. BlastP同源搜索表明, AsⅡC259多肽链仅与一个来自羽扇豆(Lupinus luteus)根瘤的新结瘤素蛋白表现出较低的同源性. 对于AsG2511多肽链, 没有发现任何明显的同源序列. Virtual Northern blot和半定量RT-PCR分析表明, AsⅡC259和 AsG2511均只在接种根中表达, 说明它们确为结瘤特异性基因; 另外, 这2个基因的表达比豆血红蛋白基因晚2~4 d, 应为晚期结瘤素基因.     

人工诱发冬瓜根瘤中的内生菌

本文报道对王曼新人工诱发冬瓜根瘤内生菌的初步观察结果。实验用的冬瓜根瘤样品由作者采自王曼新的试验田。实验方法是光学显微镜和电子显微镜的镜检术。对冬瓜根瘤切片的观察表明:根瘤中确有许多细菌。这些细菌存在于瘤细胞的细胞质中,而未见于胞间隙中。这些细胞质中的细菌与宿主瘤细胞呈共生关系,其体外皆无包囊膜包绕。它们在形态上与根瘤菌相似,而且大部分显示出根瘤菌类菌体的形态。有些细菌还在分裂。电镜观察所见与已报道的这种冬瓜根瘤具有固氮酶活性的现象是一致的。     

紫云英根瘤的分子氢再利用与固氮活性

大部分的豆科根瘤都可将ATP支持的固氮反应所生成的分子氢释放出来。由于豆科根瘤系统的固氮受光合产物供应的限制,因此,豆科根瘤的放氢被认为是一种耗能过程,导致固氮功效下降。 少数经筛选的根瘤菌,其形成的根瘤由于具有催化吸收分子氢的氢酶系统,因此不释放出分子氢;亦由于吸氢酶回收利用了固氮反应所放出的大量氢气,所以这样的根瘤就更为有     

噬菌体纯化方法的比较研究

噬菌体分离后,一般采用挑取法进行纯化而获得大小一致的溶菌班。但对某些细菌的噬菌体利用挑取法往往在平板上出现大小极不一致的溶菌斑。我们最初分离根瘤菌噬菌体时也观察到同样的清况,因此考虑到采用几种纯化的方法作比较,以获得大小一致的溶菌斑。本文报告这工作的结果。所采用的细菌为豌豆根瘤菌(Rhizobium legu-minosarum),由山东大学微生物教研室供给,编号59。一种是未经纯化的混合根瘤菌株(至少含两株,简称R_(59)),仅用于吸附实验的部分实验中;另一种是将R_(59)纯化后的根瘤菌株(简称R_5),本文所有的实验均采用此株。细菌为20—24小时的斜面培养,加液体培养基制成的细菌悬液。     

人工诱发元麦根瘤的微生物分离检验初探

《人工诱发元麦根瘤的微生物分离检验初探》一文是对王曼新同志人工诱发根瘤的又一科学验证,是从微生物分离方面进行的。它与电镜检查(本刊4卷11期)取得一致的结果,证明瘤中具有根瘤菌、放线菌、外生菌根真菌等有益菌种,一般认为这些菌类都是具有固氮活性的。其中也包括了排除农杆菌的实验,这样就从正反两方面比较更完整的验证了王曼新同志人工诱发出来的根瘤系属固氮菌类。     

异源nifA基因对苜蓿中华根瘤菌nifA突变体的互补分析

为深入研究苜蓿中华根瘤菌NifA的特性, 分别用组成型表达的慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的nifA 基因互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体, 观察其共生表型. 结果表明, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌nifA 基因不能互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体的共生表型. 以苜蓿中华根瘤菌 nifA 突变体为遗传背景, 利用全基因组微阵列实验比较分析引入异源nifA 基因后产生的基因表达谱的变化. 结果显示, 苜蓿中华根瘤菌自身NifA蛋白引起238个基因的表达发生变化. 这些表达差异的基因分属共生、能量和中心代谢、持家、细胞结构与运输等生物学功能组. 慢生型大豆根瘤菌、紫云英根瘤菌和阴沟肠杆菌的NifA蛋白分别引起了20, 7和9个基因的表达发生变化. 这些基因主要是固氮相关基因, 但差异不及苜蓿中华根瘤菌NifA互补菌明显. 以苜蓿中华根瘤菌nifH启动子与lacZ融合基因为报道基因, 研究nifH的表达. 结果指出, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的NifA蛋白只能部分激活苜蓿中华根瘤菌nifH的表达, 激活水平分别为苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白激活率的70%和50%, 与微阵列实验结果相符.     

紫云英根瘤菌自生培养物的氢酶表达与固氮

根瘤菌吸氢酶引人注目的方面在于减少宿主植物的能量损失。尽管吸氢正反应(Hup~+)与吸氢负反应(Hup~-)菌株的比较回接试验在大豆、豌豆和豌豆类宿主植物上表明,植物干重和植物含氮量的提高与Hup~+之间尚无稳定的正相关性,但是,就植物光合产物的利用而言,与Hup~-比较,Hup~+的豌豆根瘤菌菌株显示出经济优势。氢吸收系统的效益在紫云英上也有所体现。前文,我们报道高活性的固氮酶与氢酶可在紫云英根瘤内协同形成,利用外源分子氢可提高根瘤的共生固氮活性。本文继续在自生条件下证明氢吸收活性与固氮酶的共轭表达,并表明固氮活性受氢吸收系统支持。